逆行神經(jīng)示蹤-熒光金操作流程

熒光金（Fluoro-Gold）操作流程

1.背景簡介

熒光金（Fluoro-Gold）的使用與熒光示蹤劑基本相同。主要區(qū)別在于熒光金注射后存活時間、濃度范圍、組織處理及其他組織學技術(shù)的兼容性方面更靈活。

2.保存和效期：

熒光金干粉需要4℃避光保存。按要求保存，效期可超過1年。溶解后的熒光金也應4℃避光保存，溶解后效期至少6個月。

3.溶解

 熒光金可以溶解于蒸餾水或0.9%生理鹽水中或作為懸浮液于0.2mol/L的中性磷酸鹽緩沖液中。

4.染料濃度

熒光金濃度1-10%被廣泛應用并取得良好效果。建議起始濃度4%。如果注射部位出現(xiàn)壞死或標記過于強烈，請將濃度降低至2%。如果需要更精確的定量，可參照熒光金分子量532.6Da計算。

5.熒光金注射

A. 壓力注射：壓力注射是常用的注射方式。注射體積一般1-2ul。

B．離子電滲法：用脈沖電流（打開4-10S，關(guān)閉4-10S）1-5A在10-20分鐘。

C．晶體-示蹤劑的晶體可以從微量移液管的頂端給藥。

6.術(shù)后生存期

熒光金注射后觀察到的逆行標記為2天到2個月。典型的熒光金存活期為3-5天。較長的存活期可增強遠端突起的填充，而不會使染料從細胞中擴散。

7.固定

幾乎任何固定劑或沒有固定劑都可以使用；常用含有4%甲醛的磷酸鹽中性緩沖液固定。含有高濃度重金屬（如鋨、汞）的固定劑會淬滅熒光，而高濃度（超過1%）的戊二醛可能會增加背景熒光。

8. 切片處理：

含有熒光金的組織，可以根據(jù)幾乎任何組織學檢測進行后續(xù)操作。包括固定組織的低溫恒溫切片（10um）、固定組織的冷凍切片（20um）或石蠟包埋（3-10um）組織切片等。冰凍組織切片是常用的。

9. 組合檢測方法：

組織切片可以進一步處理，通過第二標記檢測，包括：放射自顯影，HRP組化染色、免疫細胞化學或第二示蹤劑染色或熒光復染等。

10.封片，透明，蓋片

切片用明膠包被，風干，浸入二甲苯溶液中，用DPX非熒光封片劑封片。如果與第二示蹤劑不兼容，可以選擇梯度酒精脫水。如果熒光金與細胞熒光結(jié)合檢測，切片風干，直接用中性甘油緩沖液（1:2）封片。

11. 檢測

熒光金可以通過寬紫外激發(fā)濾光片的熒光金顯微鏡觀察。當組織用中性pH緩沖液處理時，會發(fā)出金色光。當組織用酸性緩沖液（如pH3.3）處理時，則會發(fā)出藍色?？梢允褂脭?shù)碼或膠片拍攝（彩色打印使用200-400 ASA film，黑白打印使用類膠片如：TRI-X）。大多數(shù)曝光時間為：10-60秒，具體取決于物鏡放大倍數(shù)和標記強度，30秒曝光時間為平均值?？梢酝ㄟ^多次曝光來同時顯示熒光金和另一種示蹤劑。因此，紫外線與亮場結(jié)合，在放射自顯影中同時定位熒光金和HRP 或銀顆粒。同樣，藍光激發(fā)也可以結(jié)合FTIC，而綠色激發(fā)光可以同時觀察碘化丙啶或溴化乙錠（一種熒光復染劑）的紅色。

其它關(guān)于熒光金應用信息：

注射方法：

對于使用微量注射器或微量移液器進行的壓力注射，熒光金應溶解在蒸餾水或0.9%的生理鹽水中。熒光金也可以用0.2M的中性磷酸緩沖液制作成懸浮液，但是懸浮顆?？赡軙氯埔浩黜敹?，因此蒸餾水或0.9%的生理鹽水是優(yōu)選的稀釋液。對于離子電滲法，在1M醋酸鹽緩沖液（pH3.3）中配置1%熒光金溶液。較好的（經(jīng)過95%乙醇，水清理）移液管頂端因為10-20um。最佳的離子電滲法參數(shù)是：用脈沖電流（打開4-10S，關(guān)閉4-10S）1-5A在10-20分鐘。

注射位點：

幾乎任何中樞或外周神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)都可以注射熒光金來進行逆行示蹤研究。在外周神經(jīng)系統(tǒng)中，可以研究神經(jīng)節(jié)和外周靶點。對于周圍神經(jīng)的研究，應切割或損傷神經(jīng)，并將其浸入或注射5%的熒光金溶液。由于熒光金不會被完整的通道纖維顯著吸收，因此必須切割或嚴重損壞纖維才能吸收染料。

熒光金運輸和存活時間：

盡管發(fā)生了順向軸突運輸，但是熒光金被用作逆向軸突示蹤劑。存活時間是不同的（特別對非常短的存活時間12小時-2天），以最大限度的提高所研究的特定神經(jīng)元系統(tǒng)中的順向運輸。對于逆行運輸，存活時間從4天到14天不等。對于大多數(shù)系統(tǒng)來說，7-14天是有效的。盡管長通路（如脊髓到腦干）和大型哺乳動物（如貓，猴子）的通路可能需要更長的存活時間（如14天）。此外，由于熒光金在逆行標記的神經(jīng)元內(nèi)保持快速輸送，幾個月的存活時間也會產(chǎn)生好的結(jié)果。對于離子電滲法，建議存活2-5天。據(jù)統(tǒng)計，哺乳動物的運輸速度為每天2cm，對于冷血動物來講，速度較慢。

組織處理：

組織處理在使用指南和最早出版物中有詳細介紹(Schmued and Fallon, 1986, Brain Research 377:147-154)。由于熒光金在許多溶劑中非常穩(wěn)定，并且在逆行標記的神經(jīng)元中保持快速輸送，因此其應用與很多組化技術(shù)相兼容。它可以與其他逆行示蹤劑、免疫熒光、PAP和ABC免疫細胞化學、HRP組化染色、放射自顯影、復染（溴化乙錠是優(yōu)選的熒光復染物）、石蠟包埋和塑料包埋一起使用。然而，如果組織未固定，在水溶液中對組織進行額外處理超過1-2小時，將導致標記神經(jīng)元的熒光金熒光損失。熒光金在電子顯微鏡中可能很有用。熒光金可用于大腦切片（已轉(zhuǎn)移到磷酸鹽緩沖液中）。切片通常用明膠包被，風干，進入二甲苯中，并用DPX封片劑封片。組織也可以在載玻片上觀察，無需進一步處理。可以用梯度醇進行脫水，或者對于免疫細胞組化，切片可以風干，用中性甘油緩沖液（1:2）封片。

檢測和拍照：

熒光金通過寬帶紫外線（UV）激發(fā)熒光顯微鏡濾光片觀察。使用與寬帶紫外線下激發(fā)的其他熒光示蹤劑（如True Blue, Fast Blue, Nuclear Yellow）相同的濾光片包，如：Leitz Phloem filter system A (Wide Band UV, Excitation filter BP 340-380), Mirror RKP 400, Barrier Filter LP 430)。由于塑料會吸收紫外線，因此不建議通過塑料培養(yǎng)皿進行觀察。推薦膠片T-Max (Kodak, black & white) and Ektachrome 200 Kodak, color slides)，曝光時間從20s到1.5min不等。

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