qPCR的CT值為何定在15-35之間？

一、擴(kuò)增曲線

擴(kuò)增曲線是描述PCR動(dòng)態(tài)進(jìn)程的曲線，擴(kuò)增曲線一般以循環(huán)數(shù)(Cycle number)為橫坐標(biāo),熒光強(qiáng)度(Fluorescence intensity)或信號(hào)量(Signal amount)為縱坐標(biāo)。典型的擴(kuò)增曲線可以分成四個(gè)時(shí)期：基線期、指數(shù)期、線性期和平臺(tái)期。

基線期：擴(kuò)增曲線的水平部分，通常在PCR反應(yīng)的前幾個(gè)循環(huán)（3-15個(gè)循環(huán)）內(nèi)。此階段擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物生成量的變化。儀器軟件會(huì)基于這階段的熒光信號(hào)計(jì)算出基線范圍。

指數(shù)期：PCR擴(kuò)增的指數(shù)增長(zhǎng)階段，擴(kuò)增曲線起峰。此時(shí)期所有反應(yīng)試劑均有盈余，DNA聚合酶保持高水平的活力，每個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物量與初始模板量符合指數(shù)關(guān)系。這是進(jìn)行定量分析的最佳時(shí)期，因?yàn)?/span>PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系。

線性期：隨著原料的消耗、產(chǎn)物的積累、酶活的損耗等，DNA的擴(kuò)增不再呈指數(shù)擴(kuò)增，熒光信號(hào)的增長(zhǎng)也逐漸放緩，反應(yīng)效率降低。產(chǎn)物量與初始模板量不再符合指數(shù)關(guān)系。

平臺(tái)期：由于底物耗盡、酶活性降低等因素，熒光信號(hào)不再增加，趨于平穩(wěn)。每個(gè)反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)間和平臺(tái)期的高低各不相同。

二、熔解曲線

熔解曲線（Dissociation curve）是隨溫度升高DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解程度的曲線。它用于分析PCR產(chǎn)物的濃度、特點(diǎn)和純度。

原理：PCR反應(yīng)結(jié)束后，通過逐漸增加溫度同時(shí)監(jiān)測(cè)每一步的熒光信號(hào)來產(chǎn)生熔解曲線。隨著溫度上升，DNA雙鏈逐漸解開，熒光染料從雙鏈中釋放出來，熒光信號(hào)降低。當(dāng)溫度達(dá)到DNA雙鏈解鏈50%時(shí)，對(duì)應(yīng)的溫度稱為熔解溫度（Tm）。

曲線分析：

單峰曲線：如果qPCR產(chǎn)物非常特異，熔解曲線在80-90℃之間會(huì)形成一個(gè)單峰。這表明只擴(kuò)增到了目的基因，沒有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

前置雜峰：在主峰前有一個(gè)前鋒，可能是比目的片段短些的非特異性片段，在溫度低一些的時(shí)候就能解開雙鏈，也可能是引物二聚體。

后置雜峰：躲在主峰后面的是比目的片段長(zhǎng)些的非特異性片段，在溫度高一些的時(shí)候才能解開雙鏈。

寬峰：如果非特異性產(chǎn)物Tm值與目的條帶的Tm值接近，熔解曲線可能出現(xiàn)寬峰。

擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle Threshold，Ct）在qPCR（實(shí)時(shí)熒光定量PCR）中是一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，代表PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。

三、Ct值的定義

Ct值：全稱為Cycle Threshold，即在PCR反應(yīng)中，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。簡(jiǎn)單來說，就是熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。

Ct值的意義與范圍

Ct值與模板量的關(guān)系：衡量PCR擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值的循環(huán)次數(shù)。? Ct值越小，表示樣本中靶標(biāo)核酸的起始拷貝數(shù)越多；Ct值越大，則表示起始拷貝數(shù)越少?Ct值與起始模板量的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系。

Ct值的范圍：在正常情況下，Ct值的范圍通常在15-35之間。Ct值小于15可能意味著擴(kuò)增在基線期范圍內(nèi)，未達(dá)到熒光閾值；而Ct值大于35則可能意味著模板起始拷貝數(shù)過低，擴(kuò)增效率不佳或存在非特異性擴(kuò)增，結(jié)果無意義。

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