逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）實(shí)驗(yàn)詳解

實(shí)驗(yàn)步驟:

一、總RNA的提取
總RNA提取可以：（1）獲得高純度、高質(zhì)量的總RNA；（2）可以滿足生物學(xué)下游實(shí)驗(yàn)Northern Blot、核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)、RT-PCR、qRT-PCR 和陣列分析所需。

二、cDNA第一鏈的合成
目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一?，F(xiàn)以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。

1． 在0.5 ml微量離心管中，加入總RNA 1-5 μg，補(bǔ)充適量的DEPC H2O使總體積達(dá)11 μl。在管中加10 μM Oligo（dT）12-18 1 μl，輕輕混勻、離心；

2．70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min；

3． 取0.5 ml PCR管，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA 2 μl；上游引物（10 pM） 2 μl；下游引物（10 pM） 2 μl；dNTP(2mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl） 1 μl。輕輕混勻，離心。42℃孵育2-5 min；
4．加入SuperscriptⅡ1 μl ，在42℃水浴中孵育50 min；

5． 于70℃加熱15 min以終止反應(yīng)；

6．將管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min，降解殘留的RNA。-20℃保存?zhèn)溆谩?br/>

三、PCR
1．取0.5 ml PCR管，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA   2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP(2 mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl；

2．加入適量的ddH2O，使總體積達(dá)50 μl。輕輕混勻，離心；

3．設(shè)定PCR程序。在適當(dāng)?shù)臏囟葏?shù)下擴(kuò)增28-32個循環(huán)。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠與準(zhǔn)確，可在PCR擴(kuò)增目的基因時，加入一對內(nèi)參（如G3PD）的特異性引物，同時擴(kuò)增內(nèi)參DNA，作為對照；

4．電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果；

5．密度掃描、結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶進(jìn)行密度掃描。

注意事項(xiàng):

1．在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂；

2． 為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對照；

3．內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；

4． PCR不能進(jìn)入平臺期，出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對于每一個目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來確定；

5． 防止DNA的污染： 采用DNA酶處理RNA； 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。

其他:

1．反轉(zhuǎn)錄酶的選擇

（1） Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃；

（2）禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃；

（3）Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn2+存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA，以消除RNA模板的二級結(jié)構(gòu)；

（4）MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H-突變體：商品名為Superscript 和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，這一特性允許從含二級結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。

2．合成cDNA引物的選擇

（1） 隨機(jī)六聚體引物：當(dāng)特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時，可采用隨機(jī)六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴(kuò)增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。

（2） Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。

（3）特異性引物：最特異的引發(fā)方法是用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應(yīng)用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA 3’端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。