各類聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)特性及缺點(diǎn)

      PCR (polymerase chain reaction)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是體外DNA擴(kuò)增技術(shù)之一，至今已經(jīng)超過30年的歷史。

PCR基本原理：

PCR可以將目標(biāo)DNA片段擴(kuò)增一百萬倍以上，其原理是在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。

標(biāo)準(zhǔn) PCR 過程分為三步：

1.變性（Denaturation）：利用高溫使DNA 雙鏈分離。DNA雙鏈之間的氫鍵在高溫下（93- 98℃）被打斷。

2.退火（Annealing）：在 DNA 雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA 上。

3.延伸（Extension）：DNA 聚合酶由降溫時(shí)結(jié)合上的引物處開始沿著DNA 鏈合成互補(bǔ)鏈，延伸完成，則完成一輪循環(huán)，DNA片段數(shù)增加一倍。

往復(fù)循環(huán)這三個(gè)步驟25-35 次，DNA 片段數(shù)將得到指數(shù)級(jí)增加。

PCR的巧妙之處在于針對(duì)不同的目標(biāo)基因可以設(shè)計(jì)不同的引物，使目標(biāo)基因片段在短時(shí)間內(nèi)得到百萬級(jí)的放大。

目前為止，PCR可以分為三類，分別是普通PCR、熒光定量PCR和數(shù)字PCR。

第一代普通PCR

采用普通PCR 擴(kuò)增儀來對(duì)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，然后采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，只能做定性分析。

第一代PCR主要缺點(diǎn)：

容易發(fā)生非特異性擴(kuò)增和假陽性結(jié)果。

檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣。

只能做定性檢測(cè)。

第二代熒光定量PCR

熒光定量PCR（Real-Time PCR），也叫做qPCR，通過在反應(yīng)體系中加入能夠指示反映進(jìn)程的熒光探針，通過熒光信號(hào)的積累來監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的積累，通過熒光曲線來判斷結(jié)果，并可以借助Cq 值和標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量。

qPCR 技術(shù)由于操作過程在封閉體系中進(jìn)行，降低了污染概率，并且可以通過對(duì)熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)從而進(jìn)行定量檢測(cè)，因此臨床應(yīng)用最為廣泛，已成為PCR中的主導(dǎo)技術(shù)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為：TaqMan熒光探針、分子信標(biāo)和熒光染料。

1)TaqMan熒光探針：

PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。

探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成全同步。

2)SYBR熒光染料：

在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。

3)分子信標(biāo)

是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會(huì)產(chǎn)生熒光。

PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì)，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。

第二代PCR主要缺點(diǎn)：

靈敏度還有欠缺，低拷貝標(biāo)本檢測(cè)不準(zhǔn)確。

存在背景值影響，結(jié)果易受干擾。

當(dāng)反應(yīng)體系中有PCR抑制物時(shí)，檢測(cè)結(jié)果易受干擾。

第三代數(shù)字PCR

數(shù)字PCR（DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR）通過終點(diǎn)檢測(cè)計(jì)算目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，無需采用內(nèi)參和標(biāo)準(zhǔn)曲線即可進(jìn)行精確的絕對(duì)定量檢測(cè)。

數(shù)字PCR采用終點(diǎn)檢測(cè)，不依賴于Ct值（循環(huán)閾值），所以數(shù)字PCR反應(yīng)受擴(kuò)增效率的影響降低，對(duì)PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力提高，具有很高的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。

由于具備高靈敏度、高精確度的特點(diǎn)，不易被PCR反應(yīng)抑制劑干擾，無需標(biāo)準(zhǔn)品可實(shí)現(xiàn)真正意義的絕對(duì)定量，而成為研究和應(yīng)用熱點(diǎn)。

根據(jù)反應(yīng)單元的不同形式，主要可分為微流體式、芯片式和微滴式三大類系統(tǒng)。

1)微流體數(shù)字PCR，Microfluidic digital PCR，mdPCR。

基于微流控技術(shù)，對(duì)DNA模板進(jìn)行分液，微流控技術(shù)能實(shí)現(xiàn)樣品納升級(jí)或更小液滴的生成，但液滴需要特殊吸附方式再與PCR反應(yīng)體系結(jié)合，mdPCR已逐漸被其他方式取代。

2)微滴數(shù)字PCR，Droplet-based digital PCR，ddPCR。

利用油包水微滴生成技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理，將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬個(gè)納升級(jí)的微滴，其中每個(gè)微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子。

第三代PCR主要缺點(diǎn)：

儀器和試劑昂貴。

模板質(zhì)量要求較高，模板量超過微體系量將導(dǎo)致無法定量，過少則定量準(zhǔn)確度降低。

當(dāng)存在非特異性擴(kuò)增時(shí)也會(huì)產(chǎn)生假陽性。

PCR的各種延伸技術(shù)

1.遞減PCR（touchdown PCR）：前幾循環(huán)溫度逐漸下降。

2.逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）：以由mRNA逆轉(zhuǎn)錄而來的cDNA 為模板，也因?yàn)槭菑谋憩F(xiàn)型基因來進(jìn)行增量的，由此產(chǎn)生出來的cDNA 產(chǎn)物不帶有內(nèi)含子（基因中不具意義的段落），常應(yīng)用于分子克隆技術(shù)。

3.熱啟動(dòng)PCR（hotstart PCR）：以高熱激活型核酸聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，減少非專一性產(chǎn)物。

4.巢式PCR（nested PCR）：先用低特異性引物擴(kuò)增幾個(gè)循環(huán)以增加模板數(shù)量，再用高特異性引物擴(kuò)增。

5.多重PCR（multiplex PCR）：在同一個(gè)管中使用多組引物。

6.復(fù)原條件PCR（reconditioning PCR）：PCR 產(chǎn)物稀釋 10 倍后重新放入原濃度的引物和dNTP 等循環(huán) 3 次，以消除產(chǎn)物中的異二聚體。

7.dsRNA 合成（dsRNA replicator）：合并使用high-fidelity DNA polymersae、T7RNA聚合酶與Phi6 RNA replicase；從雙股 DNA轉(zhuǎn)錄為對(duì)應(yīng)的雙股RNA（dsRNA）?？蓱?yīng)用于RNAi實(shí)驗(yàn)操作。

8.COLD-PCR (co-amplification at lower denaturation temperature PCR):用以檢測(cè)突變或特殊等位基因的PCR 應(yīng)用技術(shù)。