布魯克的IsoSpark/IsoLight單細(xì)胞功能蛋白質(zhì)組學(xué)分析平臺(tái)近些年被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞療法的臨床前和臨床試驗(yàn)當(dāng)中，對(duì)回輸前或回輸后的免疫細(xì)胞的分泌蛋白組進(jìn)行評(píng)估。并且已經(jīng)有多篇研究表明免疫細(xì)胞的多功能性（分泌兩種或兩種以上細(xì)胞因子細(xì)胞占比）和PSI（多功能強(qiáng)度指數(shù)，多功能細(xì)胞和其分泌的細(xì)胞因子強(qiáng)度）與患者的預(yù)后具有相關(guān)性。今天與大家分享近期發(fā)表在Nature子刊上面的三篇文章，覆蓋的研究方向包括CAR-T和 CAR-NKT細(xì)胞的臨床前細(xì)胞效能的影響因素，以及一項(xiàng)臨床I/II期的通用型CAR-NK細(xì)胞產(chǎn)品的成果。

01

CAR親和力調(diào)節(jié)CAR-T細(xì)胞

對(duì)PD-1/PD-L1介導(dǎo)抑制的敏感性

發(fā)表期刊

Nature Communications

文章題目

CAR affinity modulates the sensitivity of CAR-T cells to PD-1/PD-L1-mediated inhibition

通訊作者單位

西班牙IDIBAPS研究所

研究主要內(nèi)容

針對(duì)實(shí)體瘤的CAR-T細(xì)胞療法面臨著重重阻礙，其中包括由PD-1/PD-L1軸介導(dǎo)的T細(xì)胞抑制。研究者已經(jīng)在探索不同破壞PD-1/PD-L1軸對(duì)T細(xì)胞的影響。在這項(xiàng)工作中，研究者假設(shè)CAR-抗原親和力可能是調(diào)節(jié)T細(xì)胞對(duì)PD-1/PD-L1軸敏感性的關(guān)鍵因素。他們?cè)诟鞣N臨床前模型中系統(tǒng)地研究了以低親和力（LA）或高親和力（HA）靶向HER2的CAR-T細(xì)胞。通過(guò)使用腫瘤細(xì)胞系的體外模型和經(jīng)過(guò)修改以顯示不同PD-L1密度的支持脂質(zhì)雙層，研究人員發(fā)現(xiàn)LA CAR-T細(xì)胞對(duì)PD-L1介導(dǎo)的抑制的敏感性比HA細(xì)胞增加。PD-1敲除可增強(qiáng)LA CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌和體外多功能性以及體內(nèi)抗腫瘤作用，并導(dǎo)致與T細(xì)胞衰竭相關(guān)的基因特征下調(diào)。相比之下，HA CAR-T細(xì)胞特征在PD-1敲除后不受影響。這項(xiàng)研究結(jié)果可能為涉及破壞PD-1/PD-L1通路的CAR-T療法提供信息，幫助更加有效地治療實(shí)體瘤。

單細(xì)胞分泌蛋白組分析證明PD-1敲除可增強(qiáng)低親和力而非高親和力CAR-T細(xì)胞的多功能性

研究者在bulk RNA測(cè)序分析中發(fā)現(xiàn)涉及編碼細(xì)胞因子的基因的轉(zhuǎn)錄本變化，并且由于CAR-T細(xì)胞的多功能性之前已證明與臨床結(jié)果的改善相關(guān)，因此他們了評(píng)估PD-1敲除是否會(huì)增加HER2-28Z CAR-T細(xì)胞在抗原暴露后的多功能性。研究者使用布魯克的IsoCode適應(yīng)性免疫細(xì)胞因子芯片對(duì)抗原暴露后的低親和力（LA）和高親和力（HA）HER2-28Z CAR-T細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞分泌組分析。

在3D t-SNE分析中觀察到Mock組和PD-1敲除的LA CAR-T細(xì)胞分離成不同的簇，揭示了兩組之間的關(guān)鍵功能差異（圖1a）。相比之下，PD-1的敲除對(duì)于HA CAR-T的影響并不明顯（圖1b）。這些結(jié)果與之前的基因表達(dá)分析一致。更深入的分析中，LA HER2-28Z CAR-T細(xì)胞中PD-1敲除顯示出在CD4+和CD8+ T細(xì)胞群中多功能細(xì)胞（能夠分泌兩種或兩種以上細(xì)胞因子）增加的趨勢(shì)（圖1c），且由于LA HER2 CAR-T細(xì)胞中的PD-1破壞，其總體的PSI（多功能強(qiáng)度指數(shù)）增加，在分析的32種細(xì)胞因子中效應(yīng)細(xì)胞因子占主導(dǎo)地位（圖1e）。相反，在HA HER2-28Z CAR-T細(xì)胞中敲除PD-1并沒(méi)有顯著增加T細(xì)胞的多功能性或PSI，這意味著PD-1破壞的影響較?。▓D1d、f）。單細(xì)胞分泌組分析還表明，LA PD-1 KO CAR-T細(xì)胞中IL-13、IL-22或IL-4等調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子的表達(dá)降低，而PD- L1敲除并沒(méi)有改變HA CAR-T細(xì)胞中這些細(xì)胞因子的表達(dá)（補(bǔ)充圖）。以上結(jié)果表明，與T細(xì)胞活化相關(guān)的基因上調(diào)以及增強(qiáng)的多功能性可能有助于提高 LA HER2-28Z PD-1 KO的抗腫瘤功效。

圖1. PD-1 KO LA 和 HA HER2-28Z CAR-T細(xì)胞的多功能性分析。

02

IL-12將表達(dá)CAR的自然殺傷T細(xì)胞重編程

為具有強(qiáng)效抗腫瘤活性的長(zhǎng)壽Th1極化細(xì)胞

發(fā)表期刊

Nature Communications

文章題目

IL-12 reprograms CAR-expressing natural killer T cells to long-lived Th1-polarized cells with potent antitumor activity

通訊作者單位

美國(guó)北卡羅來(lái)納大學(xué)Lineberger綜合癌癥中心

研究主要內(nèi)容

人類自然殺傷T細(xì)胞（NKT）被越來(lái)越多地用于癌癥免疫治療。這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-12（IL-12）能夠使人NKT經(jīng)歷廣泛且持續(xù)的分子和功能重編程。具體來(lái)說(shuō)，IL-12在體內(nèi)指導(dǎo)并維持NKT中的Th1極化程序，而不會(huì)導(dǎo)致其功能衰竭。此外，IL-12在體內(nèi)能夠維持長(zhǎng)期表達(dá)CD62L的記憶NKT。值得注意的是，IL-12啟動(dòng)CD62L陰性NKT中記憶NKT的從頭編程，表明外周血中循環(huán)的NKT具有內(nèi)在的分化層次，并且IL-12能夠促進(jìn)NKT分化為長(zhǎng)壽命的Th1極化記憶細(xì)胞。經(jīng)設(shè)計(jì)以共表達(dá)嵌合抗原受體（CAR）并結(jié)合IL-12表達(dá)的人類NKT在白血病和神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤模型中抗腫瘤活性增強(qiáng)，在體內(nèi)能長(zhǎng)期持續(xù)并保留由IL-12表達(dá)驅(qū)動(dòng)的分子特征。IL-12揭示出人外周NKT的內(nèi)在可塑性，這可能在細(xì)胞療法的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

單細(xì)胞分泌蛋白組分析表達(dá)

IL-12的NKT細(xì)胞的功能變化

研究者首先構(gòu)建了表達(dá)IL-12的NKT細(xì)胞。他們從外周血中分離、擴(kuò)增和轉(zhuǎn)導(dǎo)人類NKT。將GFP與IL-12的兩個(gè)亞基進(jìn)行融合表達(dá)。NKT的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和純度分別高于70%和90%。IL-12可在L12(I)GFP NKT上清液中檢測(cè)到。與對(duì)照GFP NKT相比，IL12(I)GFP NKT表現(xiàn)出更高的IFN-γ釋放和降低的IL-4釋放。相應(yīng)的qPCR分析也檢測(cè)到L12(I)GFP NKT中 IFN-γ和T-bet的mRNA升高。

研究者進(jìn)一步評(píng)估了IL-12表達(dá)是否促進(jìn)多功能NKT的產(chǎn)生。NKT用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中GFP被ΔNGFR交換以允許對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)的NKT進(jìn)行分選和處理，以在單細(xì)胞分辨率下評(píng)估多功能性。表達(dá)IL12的活化NKT顯示出明顯更高的多功能性（分泌兩種或更多種細(xì)胞因子的細(xì)胞百分比）（圖2j和圖3D）。此外，與對(duì)照NKT相比，表達(dá)IL-12的NKT顯示出更高的多功能強(qiáng)度指數(shù)（PSI，多功能性與細(xì)胞因子分泌強(qiáng)度的組合)，并且顯示出明顯更高的效應(yīng)子和炎癥PSI (圖3E)?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)表明表達(dá)IL-12的NKT是多功能Th1極化細(xì)胞，并且IL-12具有自分泌/旁分泌作用模式。

圖2. 表達(dá)IL-12對(duì)NKT功能的影響。

圖3.表達(dá)IL-12對(duì)NKT多功能性和PSI的影響

03

同種異體CD19特異性CAR-NK細(xì)胞

在CD19+ B細(xì)胞腫瘤中的安全性、有效性

及響應(yīng)決定因素的一項(xiàng)臨床1/2期試驗(yàn)

發(fā)表期刊

Nature Medicine

文章題目

Safety, efficacy and determinants of response of allogeneic CD19-specific CAR-NK cells in CD19+ B cell tumors: a phase 1/2 trial

通訊作者單位

美國(guó)MD安德森癌癥中心干細(xì)胞移植和細(xì)胞治療系

研究主要內(nèi)容

該研究是針對(duì)37名復(fù)發(fā)或難治性CD19陽(yáng)性B細(xì)胞惡性腫瘤患者開展一項(xiàng)I/II期試驗(yàn)，試驗(yàn)對(duì)象是同種異體臍帶血來(lái)源的表達(dá)抗CD19嵌合抗原受體和白細(xì)胞介素15的自然殺傷細(xì)胞（CAR19/IL-15 NK）。結(jié)果顯示，患者沒(méi)有出現(xiàn)嚴(yán)重細(xì)胞因子釋放綜合征、神經(jīng)毒性或移植物抗宿主病。第30天和第100天的OR率均為48.6%。一年總生存率和無(wú)進(jìn)展生存率分別為68%和32%，獲得OR的患者有更高水平的CAR-NK細(xì)胞數(shù)量和更長(zhǎng)的持久性。還發(fā)現(xiàn)臍帶血單位（CBU）接收時(shí)有核紅細(xì)胞≤8×107且采集到凍存時(shí)間≤24小時(shí)是CAR-NK獲得優(yōu)異結(jié)果的最重要預(yù)測(cè)因素。來(lái)自最佳CBU的NK細(xì)胞具有高度功能性且高表達(dá)效應(yīng)相關(guān)基因。而來(lái)自次優(yōu)CBU的NK細(xì)胞會(huì)上調(diào)炎癥、缺氧和細(xì)胞應(yīng)激程序。這些發(fā)現(xiàn)揭示了CAR-NK細(xì)胞生物學(xué)的新特點(diǎn)，并強(qiáng)調(diào)了供體選擇對(duì)于同種異體細(xì)胞療法的重要性。

單細(xì)胞分泌蛋白組分析Opt-Cs和Sub-Cs

中NK細(xì)胞的功能

為了確定基于臍帶血單位質(zhì)量的治療效果差異的潛在機(jī)制，分別比較了從最佳（Opt-Cs）和次優(yōu)（Sub-Cs）CBU得到的CAR-NK細(xì)胞。研究者首先比較了輸注產(chǎn)品中CAR的表達(dá)、體外增殖和表型，這些參數(shù)在Opt-Cs和Sub-Cs的NK細(xì)胞之間沒(méi)有顯著差異。體外長(zhǎng)期腫瘤再攻擊試驗(yàn)表明，雖然Opt-Cs和Sub-Cs中的CAR19/IL-15 NK細(xì)胞在單次腫瘤攻擊后消除CD19陽(yáng)性Raji細(xì)胞的效果相同，但Sub-Cs中的CAR19/IL-15 NK細(xì)胞在再攻擊后失去了控制腫瘤生長(zhǎng)的能力。多功能性和代謝適應(yīng)性是有效抗腫瘤NK細(xì)胞反應(yīng)的重要決定因素。IsoCode單細(xì)胞分泌蛋白組芯片檢測(cè)結(jié)果表明，與Sub-Cs相比，來(lái)自O(shè)pt-Cs的CAR19/IL-15 NK細(xì)胞對(duì)CD19抗原刺激的多功能強(qiáng)度指數(shù)（PSI）明顯更高（圖4b）。線粒體代謝和糖酵解活性分析顯示，來(lái)自O(shè)pt-Cs的CAR19/IL-15 NK細(xì)胞的氧化磷酸化更高(圖4c )，而其糖酵解能力沒(méi)有差異 (圖4d )，這表明線粒體適應(yīng)性更高。為了驗(yàn)證在臨床CAR19/IL-15 NK細(xì)胞產(chǎn)品中觀察到的結(jié)果，研究者從臍帶庫(kù)中選擇了12個(gè)額外的CBU來(lái)生成CAR-NK 細(xì)胞。研究者還證實(shí)了Opt-C對(duì)CAR-NK細(xì)胞和NT-NK細(xì)胞均具有優(yōu)異的PSI和線粒體適應(yīng)性。

圖4.臨床CAR19/IL-15 CBU-NK細(xì)胞在Opt-Cs和Sub-Cs中的功能差異