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二胺氧化酶(DAO)活性檢測試劑盒（可見分光光度法）

來源：上海尚寶生物科技有限公司 2024年10月28日 10:47

二胺氧化酶(DAO)活性檢測試劑盒（可見分光光度法）

產(chǎn)品貨號：BA1089

產(chǎn)品規(guī)格：50管/24樣

產(chǎn)品簡介：

DAO(EC1.4.3.6)廣泛存在于動物（腸粘膜、肺、肝臟、腎臟等）、植物和微生物中。催化多胺氧化為醛，其活性與核酸和蛋白合成密切相關，能夠反映腸道機械屏障的完整性和受損傷程度。

DAO催化尸胺產(chǎn)生醛和過氧化氫，外源添加過量的辣根過氧化物酶，催化過氧化氫氧化鄰聯(lián)茴香胺生成有色物質(zhì)，在500nm處有特征吸收峰，通過測定該波長吸光度增加速率，計算DAO活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑名稱	規(guī)格	保存條件
提取液	液體60mL×1瓶	2-8℃
試劑一	液體0.6mL×1支	2-8℃
試劑二	粉劑×1瓶	2-8℃
試劑三	液體1.5mL×1瓶	2-8℃

溶液的配制：

試劑二：液體置于試劑瓶內(nèi)玻璃瓶中。臨用前加入6mL蒸餾水溶解，4℃可保存1個月。

需自備的儀器和用品：

天平、低溫離心機、可見分光光度計、1mL玻璃比色皿、蒸餾水、無水乙醇、研缽/勻漿器、水浴鍋。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測。

2. 細菌、細胞：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3. 血清等液體：直接測定。

二、測定操作表：

1. 分光光度計預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至500nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 操作表

試劑名稱（mL）	對照管	測定管
樣本	0.25	0.25
提取液	0.59	0.59
試劑一	0.01	0.01
試劑二	0.1	0.1
試劑三	-	0.05
無水乙醇	0.05	-
混勻，37℃水浴30min后于1mL玻璃比色皿中測定500nm下吸光度，ΔA=A測定-A 對照。

三、酶活性計算公式：

1. 組織DAO活力的計算

（1）按蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘催化產(chǎn)生1μmol氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個酶活力單位。

DAO（U/mg prot）=ΔA÷d÷ε×V反總÷(cpr×V樣本)÷T=18×ΔA÷cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘催化產(chǎn)生1μmol氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個酶活力單位。

DAO（U/g 鮮重）=ΔA÷d÷ε×V反總÷(W÷V提取×V樣本)÷T=18×ΔA÷W

2. 血清（漿）DAO活力的計算

單位的定義：每mL血清（漿）在反應體系中每分鐘催化產(chǎn)生1μmol氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個酶活力單位。

DAO（U/mL）=ΔA÷d÷ε×V反總÷V樣本÷T=18×ΔA

3. 按細胞數(shù)量計算：

單位的定義：每10⁴個細胞在反應體系中每分鐘催化產(chǎn)生1μmol氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個酶活力單位。

DAO活性（U/10⁴cell）=ΔA÷d÷ε×V反總÷（500×V樣÷V提?。?/span>÷T= 0.036×ΔA

V反總：反應總體積，1mL；V樣本：加入樣本的體積，0.25mL；V提取，加入提取液體積，1mL；cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；d：1mL玻璃比色皿光徑，1cm；ε：氧化型鄰聯(lián)茴香胺消光系數(shù)，7.5×10^-3mL/μmol/cm；T：反應時間，30min；500：細胞總數(shù)，500萬。

注意事項：

1. 如果ΔA小于0.01，適當加大提取用樣本質(zhì)量；ΔA大于0.8，樣本可用提取液適當稀釋，或者減少提取用樣本質(zhì)量。

2. 樣品蛋白質(zhì)含量需要另外測定。