先前研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能夠通過調(diào)節(jié)NLRP3磷酸化抑制NLRP3介導的細胞焦亡，因此，研究者希望進一步了解黃芩苷對泛凋亡的抑制機制。研究者接著探討黃芩苷對泛凋亡細胞死亡的抑制作用是否依賴于NLRP3或Caspase-1的表達。具體實驗思路如下：

1.實驗設計：

使用兩種類型的巨噬細胞：野生型（WT）BMDMs和基因敲除（Nlrp3-/-和Casp1-/-）BMDMs。

采用OXO和TNF-α組合處理這些細胞，以誘導泛凋亡的發(fā)生。使用PI染色法檢測細胞裂解性死亡，比較在不同細胞類型中，黃芩苷的抑制效果。

2. 結(jié)果分析：

無論是使用Nlrp3-/-細胞還是Casp1-/-細胞，OXO+TNF-α誘導的裂解性細胞死亡水平均相似，這表明泛凋亡的激活與NLRP3或CASP1的表達無關。

進一步結(jié)果顯示，黃芩苷在兩種細胞中均顯示出相似的抑制作用。

結(jié)論：上述結(jié)果表明OXO+TNF-α誘導的泛凋亡并不依賴于NLRP3或Caspase-1，因此，黃芩苷對泛凋亡的抑制作用可能是通過非NLRP3/CASP1相關的其他信號通路實現(xiàn)的。本實驗展示黃芩苷的抑制機制不依賴于NLRP3或Caspase-1，為后續(xù)探索其具體作用機制提供了方向。

圖2 黃芩苷抑制作用不依賴于NLRP3或CASP1（圖源[1]）

PANoptosome組裝涉及ASC（細胞焦亡信號成分）、CASP8（細胞凋亡信號成分）、RIPK1、RIPK3、MLKL（壞死性凋亡信號成分）和ZBP1。研究目的是確認黃芩苷是否能影響PANoptosome的組裝。

研究者探討了黃芩苷對ZBP1相關PANoptosome組裝的影響。PANoptosome是突觸細胞死亡信號的關鍵分子平臺，通過整合細胞焦亡、凋亡和壞死性凋亡的信號來激活泛凋亡。具體實驗思路如下：

1.實驗方法：

未處理的細胞或處理TNF-α的細胞作為對照，免疫熒光顯微鏡觀察核心組分（MLKL、CASP8、ASC、RIPK3、RIPK1、ZBP1）在基線狀態(tài)下的分布情況。

使用OXO+TNF-α處理誘導泛凋亡，觀察這些蛋白在死亡細胞中的聚集行為，特別是ASC的斑點與其他信號通路成分的共定位。評估黃芩苷預處理對這些信號成分聚集和共定位的影響。

使用免疫共沉淀實驗驗證ASC、RIPK3、ZBP1和CASP8之間的相互作用。但在實施時，考慮到PANoptosome可能在Co-IP裂解緩沖液中不溶，轉(zhuǎn)而分別分析可溶和不可溶部分。

通過Western blot分析可溶性的ZBP1、RIPK1、RIPK3、MLKL、CASP8、NLRP3和ASC的水平。在OXO+TNF-α處理后，可溶組分中這些蛋白顯著降低，而不溶組分中則顯著增加。

2. 結(jié)果分析：

在OXO+TNF-α處理下，觀察到關鍵成分的聚集與共定位，尤其是ASC、ZBP1、RIPK3的共定位現(xiàn)象，表明PANoptosome的組裝。

黃芩苷預處理顯著抑制了這些蛋白的聚集和共定位，說明黃芩苷能有效阻斷PANoptosome的形成。黃芩苷預處理后，抵消了OXO+TNF-α誘導的這些信號成分從可溶相向不可溶相的募集，進一步驗證了PANoptosome的組裝受阻。

結(jié)合免疫熒光顯微鏡的觀察，結(jié)果得出黃芩苷確實有效阻斷了PANoptosome的組裝。

綜上，本實驗表明黃芩苷通過抑制PANoptosome的組裝，從而影響泛凋亡的激活。這為深入理解黃芩苷在調(diào)節(jié)細胞死亡信號中的作用提供了重要依據(jù)。

圖 3黃芩苷抑制PANoptosome 形成（圖源[1]）

線粒體在調(diào)節(jié)多種細胞死亡機制中扮演重要角色，特別是在細胞凋亡和泛凋亡中，線粒體的功能和健康狀態(tài)對細胞命運有重大影響。本實驗旨在探討線粒體損傷與泛凋亡的關系，以及黃芩苷的保護作用。研究者探索了線粒體在誘導泛凋亡中的作用，并評估了黃芩苷在這一過程中所起的保護作用。具體實驗思路如下：

1.線粒體膜電位（MMP）的測定：

使用TMRE探針檢測線粒體膜電位。當細胞內(nèi)MMP正常時，TMRE染料積累在線粒體，并發(fā)出紅色熒光；當MMP受損時，TMRE的熒光強度會降低。

使用JC-1染料檢測相同參數(shù)。在正常情況下，JC-1形成聚集體顯紅色，當MMP降低時，JC-1轉(zhuǎn)為單體并擴散至細胞質(zhì)顯綠色。

2. ROS的檢測：

用DCFH-DA探針檢測細胞內(nèi)總ROS水平，觀察到在OXO+TNF-α或OXO+LPS處理后，總ROS顯著上升，黃芩苷處理則有效抑制了這一上升。

使用MitoSOX探針檢測線粒體內(nèi)ROS水平，實驗結(jié)果顯示OXO+TNF-α或OXO+LPS處理后mtROS顯著增加，而黃芩苷也能夠抑制mtROS的產(chǎn)生。

在細胞核中觀察到強烈的MitoSOX熒光，可能與線粒體受損導致的細胞膜透化有關。

3. 結(jié)果分析：

圖 4黃芩苷可減輕線粒體損傷（圖源[1]）

研究者旨在探討線粒體源性活性氧（mtROS）與泛凋亡之間的因果關系，并闡明黃芩苷如何通過影響mtROS的生成及氧化態(tài)mtDNA（Ox-mtDNA）的形成來抑制泛凋亡。具體實驗思路如下：

1. 確認因果關系：

mtROS的清除與促進：使用線粒體靶向清除劑mito-TEMPO來抑制mtROS，提高對OXO+TNF-α誘導的泛凋亡細胞死亡的抑制效果。同時，使用kang霉素A(AA)促進mtROS的生成，觀察其對黃芩苷抑制細胞死亡的影響。

通過PI染色定量細胞存活，結(jié)果表明mito-TEMPO通過劑量依賴減少泛凋亡，而AA則加重細胞死亡，從而確認mtROS在泛凋亡中的因果作用。

2. Ox-mtDNA的角色：

細胞內(nèi)氧化態(tài)DNA的觀察：使用免疫熒光顯微鏡明確顯示OXO+TNF-α誘導后形成的氧化態(tài)mtDNA（使用8-OHdG抗體）與線粒體特定標記Tom20的共定位，表明Ox-mtDNA參與PANoptosome的組裝。

ASC speck的共定位：證明Ox-mtDNA與PANoptosome的組裝相關，且黃芩苷能夠抑制Ox-mtDNA的形成及PANoptosome的組裝。

3. mtDNA的釋放機制：

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)和電壓依賴性陰離子通道(VDAC)的作用：探討mtDNA通過mPTP和VDAC通道的釋放，使用環(huán)孢素A(CsA)和VBIT-4作為抑制劑，觀察其對OXO+TNF-α誘導的細胞死亡的影響，結(jié)果顯示顯著減弱細胞死亡。

mtDNA釋放的檢測：使用Triton X-100處理細胞，分離不溶性組分DNA并進行qPCR分析，結(jié)果顯示泛凋亡誘導后mtDNA顯著增加，CsA和VBIT-4的聯(lián)合處理可阻止這種增加。

4. 黃芩苷的作用機制：

mtDNA的阻斷：黃芩苷預處理有效減少不溶性組分中的mtDNA，指示其可能干擾mPTP和VDAC通道的開放。

VDAC寡聚體水平的Western blotting：顯示黃芩苷和VBIT-4均能降低由泛凋亡誘導劑引起的VDAC寡聚體的水平，進一步支持黃芩苷通過影響這些通道來抑制mtDNA釋放和泛凋亡。

綜上所述，該實驗通過證明mtROS與Ox-mtDNA在泛凋亡過程中的重要作用，闡明了黃芩苷作用的潛在機制，為黃芩苷抗泛凋亡的藥理作用提供了科學依據(jù)。這為理解線粒體功能喪失在細胞死亡調(diào)節(jié)中的角色以及藥物干預提供了理論基礎。

圖 5黃芩苷阻斷mtDNA的氧化和釋放抑制 PANoptosis（圖源[1]）

本段實驗通過去除線粒體DNA（mtDNA）進一步驗證mtDNA在泛凋亡中的作用，具體思路如下：

1. mtDNA的去除：

使用溴化乙錠（EB）：EB被用作線粒體靶向染料，能夠有效嵌入 mtDNA 中并在處理后去除線粒體DNA。通過這一處理，研究者希望評估缺失mtDNA對細胞狀態(tài)及其對泛凋亡的影響。

2. 線粒體質(zhì)量的評估：

線粒體質(zhì)量的檢測：實驗結(jié)果顯示，EB處理后，細胞內(nèi)線粒體質(zhì)量（ρ0）顯著降低，表明mtDNA的去除對線粒體的完整性產(chǎn)生了明顯影響（如圖4g,h所示）。

3. 細胞存活的測試：

PI染色分析細胞死亡：在OXO+TNF-α誘導下，觀察到EB處理的細胞中細胞死亡顯著抑制。與未處理細胞相比，缺失mtDNA的細胞展現(xiàn)出更好的生存率（如圖4i所示）。

4. 結(jié)果分析：

實驗結(jié)果表明，線粒體DNA的存在與OXO+TNF-α誘導泛凋亡之間存在關系。EB處理減弱了mtDNA的功能，從而導致細胞對誘導的死亡信號表現(xiàn)出更強的抵抗力。這些數(shù)據(jù)進一步支持了mtDNA在泛凋亡中的作用，尤其是Ox-mtDNA的氧化和釋放對于PANoptosome的組裝至關重要。通過保護線粒體免受損傷，黃芩苷能夠有效阻斷這一過程，從而抑制全腹臟下垂的發(fā)生。這一發(fā)現(xiàn)為理解細胞死亡機制中的mtDNA功能提供了重要的實驗依據(jù)。

圖6 黃芩苷阻斷泛凋亡誘導過程中Z-DNA形成（圖源[1]）

進一步研究了黃芩苷在抑制泛凋亡過程中的具體機制，特別是針對Z-DNA的形成及其與ZBP1的相互作用。具體實驗思路如下：

1. Z-DNA的形成與mtDNA的關聯(lián)：

研究表明，mtDNA在基因組不穩(wěn)定時可能轉(zhuǎn)化為Z-DNA。為了探討泛凋亡或Ox-mtDNA的釋放是否促使Z-DNA的形成，使用了抗Z-DNA/Z-RNA的抗體Z22進行免疫熒光檢測。

2. 共定位實驗：

免疫熒光顯微鏡觀察顯示，泛凋亡誘導時，ASC斑點與線粒體標記（Tom20）和Z22熒光點共定位，表明Z-DNA可能由mtDNA形成，并參與PANoptosome的組裝（如圖5a和圖S9所示）。

3. 確認Z-DNA的性質(zhì)：

為了驗證Z22標記的是Z-DNA而非Z-RNA，進行了DNase I和RNase A的預處理實驗。結(jié)果表明，僅DNase I預處理能消除Z22的熒光斑點，確認了Z-DNA的形成（如圖5b所示）。

4. 抑制劑的作用：

結(jié)合使用CsA和VBIT-4，研究發(fā)現(xiàn)這一組合顯著抑制泛凋亡時Z-DNA的形成及其與ASC的共定位（如圖6a所示）。此外，mito-TEMPO也能有效抑制Z-DNA的形成，這與其對細胞死亡的保護效果一致（如圖6b所示）。

5. ZBP1的角色：

研究推測Z-DNA可能通過ZBP1激活泛凋亡信號通路。為驗證這一假設，使用siRNA對ZBP1進行敲低。Western blotting表明敲低效率約60%（如圖7a,b所示）。PI染色和LDH釋放實驗表明，敲低ZBP1顯著減弱了OXO+TNF-α誘導的細胞死亡（如圖7c,d所示）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，ZBP1敲低的細胞泛凋亡信號顯著減弱（如圖7e,f所示），使用的另一條針對ZBP1的siRNA也獲得了類似結(jié)果（如圖S10a-f所示）。

結(jié)論：綜合這些實驗結(jié)果，Z-DNA的形成被確認是由mtDNA轉(zhuǎn)化的，并且其形成在誘導泛凋亡中起到了重要的觸發(fā)作用。黃芩苷能夠有效阻斷Z-DNA的形成，從而抑制ZBP1的激活及PANoptosome的組裝，進一步減輕細胞死亡。這一研究不僅闡明了黃芩苷的作用機制，也為理解mtDNA及其衍生物在細胞死亡中的角色提供了新的視角。

圖7 ZBP1下調(diào)可減弱OXO+TNF-α-誘導的泛凋亡（圖源[1]）

這部分實驗的結(jié)果揭示了黃芩苷在HLH（臟器系統(tǒng)激活綜合征）小鼠模型中的抗炎作用和對泛凋亡的抑制。具體實驗思路如下：

1. HLH小鼠模型的建立：

 使用poly(I:C)和LPS誘導的HLH小鼠模型被建立。該模型與泛凋亡密切相關，能夠模擬全身炎癥反應。

2. 組織損傷與炎癥評估：

組織化學分析顯示，HLH小鼠的肺和肝臟表現(xiàn)出明顯的損傷，包括肺泡塌陷、血管充血以及免疫細胞浸潤（如圖8a、8b所示）。

通過生化分析（檢測ALT和AST水平）證實了肝損傷的存在。所有這些損傷的參數(shù)在口服黃芩苷后得到顯著減輕（如圖8c、8d所示）。

3. 細胞因子測定：

在poly(I:C)/LPS處理的小鼠中，血清中的TNF-α和IFN-γ水平顯著上升，而黃芩苷處理則顯著降低了這些細胞因子的水平（如圖8e、8f所示）。黃芩苷單獨處理并未顯著影響這些組織或細胞因子的分泌。

4. 泛凋亡標志檢測：

Western blot分析顯示，poly(I:C)/LPS誘導的HLH小鼠中，肺和肝組織中的泛凋亡相關標志（如CASP1，GSDMD-NT，cleaved CASP3，GSDME-NT和p-MLKL）顯著增加（如圖8g、8h、8i、8j所示）。黃芩苷的給藥顯著降低了這些標志物的表達，表明黃芩苷可以抑制泛凋亡信號。

5. 巨噬細胞的分析：

研究發(fā)現(xiàn)，Kupffer細胞在HLH小鼠肝臟中的泛凋亡信號被激活，表現(xiàn)在ASC speck、裂解的CASP3和p-MLKL的聚集體形成。黃芩苷處理后，這些信號明顯減少（圖9a、9b所示）。這表明黃芩苷能有效抑制Kupffer細胞中的泛凋亡。

結(jié)論：本研究證實了黃芩苷作為抗炎劑的有效性，能夠通過抑制線粒體Z-DNA的形成以及PANoptosome的組裝，減輕HLH小鼠模型中的炎癥反應和多器官損傷。特別是，黃芩苷通過抑制肝臟和肺部的泛凋亡信號，顯著改善了小鼠的病理狀態(tài)。這些結(jié)果表明黃芩苷可能作為泛凋亡的潛在抑制劑，在泛凋亡相關疾病的治療中具有重要的應用前景。

圖8 黃芩苷減輕HLH小鼠模型的炎癥反應和器官損傷（圖源[1]）

綜上所述，黃芩苷能夠抑制mtROS的生成以及Ox-mtDNA和Z-DNA的形成，減少細胞的泛凋亡?？赡艿臋C制包括抗氧化作用、對mPTP及VDAC渠道的抑制等。這些機制阻止mtDNA的氧化及其轉(zhuǎn)化為Z-DNA。

在HLH小鼠模型中，黃芩苷顯著緩解了臟器損傷和全身炎癥，同時抑制了肝臟和肺部的泛凋亡信號。免疫熒光顯微鏡的結(jié)果表明，Kupffer細胞中的泛凋亡標志激活得到了顯著抑制，驗證了黃芩苷的作用。

這項研究揭示了一種新的機制，即黃芩苷通過阻斷線粒體Z-DNA的形成和PANoptosome的組裝，以劑量依賴的方式抑制巨噬細胞中的泛凋亡細胞死亡。結(jié)果支持黃芩苷作為泛凋亡抑制劑在治療炎癥相關疾病中的潛力。

未來研究應該進一步探討黃芩苷的具體作用機制，特別是其對mPTP和VDAC通道的影響。更詳細地研究ZBP1在泛凋亡中的具體功能及其調(diào)節(jié)機制，并探討其他細胞類型（如血管內(nèi)皮細胞和肝細胞）在泛凋亡中的作用。