細胞內(nèi)信號通路，也稱為信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)，在感知和整合不同的外部刺激以產(chǎn)生生物反應方面發(fā)揮著關鍵作用，最終導致細胞過程（增殖、遷移、分化、營養(yǎng)代謝……）。磷酸化反應是由激酶介導的翻譯后修飾，控制參與信號轉(zhuǎn)導蛋白質(zhì)的活性。因此，它是感興趣途徑激活狀態(tài)的反映。

就磷酸化檢測而言，最佳檢測條件不僅取決于所研究的信號轉(zhuǎn)導途徑以及所研究的化合物（激活劑或抑制劑）的藥理學特征，還取決于用于檢測的特定細胞模型（貼壁或懸浮細胞、永生化細胞系或原代細胞、腫瘤、組織……）。正確優(yōu)化檢測條件對于確保獲得最佳的試劑使用和性能至關重要。

本文以HTRF®Advanced phospho-ERK1/2kit為例，為廣大研究者提供優(yōu)化磷酸化蛋白檢測的實用技巧，讓大家更深入地了解如何優(yōu)化過程中的各個步驟以獲得最佳的檢測結(jié)果。

TIP1：Optimize cell density for the best signal amplitude（優(yōu)化細胞密度）

HTRF信號與處理產(chǎn)生的磷酸化蛋白和總蛋白的量成正比，信號隨著磷酸化蛋白濃度增加而增加，如果檢測中磷酸化蛋白質(zhì)的量明顯高于孔中存在的檢測抗體的量，則信號會下降（鉤狀效應）。有必要針對每個HTRF磷酸化或總蛋白檢測試劑盒、不同的細胞模型、甚至每個實驗條件進行細胞密度優(yōu)化，以避免鉤狀效應。

TIP2：Optimize the presence of serum in the cell culture medium（血清饑餓處理）

根據(jù)要研究的信號通路，細胞饑餓處理可能有利于減少目標蛋白質(zhì)的本底水平。通常情況下，從細胞培養(yǎng)基中去除血清是使細胞饑餓的有效方法，但對于某些細胞模型來說，血清的存在對于細胞生長或增殖至關重要。在這種情況下，可以選擇將血清濃度降低至0.5% 或不高于2%，同時應優(yōu)化血清饑餓的時間。

TIP3：Distribute compounds in the presence of cell culture medium（在細胞培養(yǎng)基存在的情況下進行加藥處理）

在將化合物/藥物分配到細胞上之前，請勿從微孔板中除去細胞培養(yǎng)基。加藥步驟中去除培養(yǎng)基會對某些磷酸化蛋白檢測產(chǎn)生不良影響。在去除培養(yǎng)基加藥的情況下，高本底水平基本上掩蓋了任何誘導的藥理學劑量反應的檢測；當培養(yǎng)基存在的情況下加藥時，本底水平較低并且可以檢測到劑量反應（見圖4）。

TIP4：Optimize stimulation time（化合物刺激時間）

評估化合物刺激時間，找出產(chǎn)生最佳信號窗口的時間。

TIP5： Add lysis buffer shortly after removal of stimulation medium（藥物處理結(jié)束后盡快加入lysis buffer）

去除刺激介質(zhì)后延遲添加裂解緩沖液可能會影響化合物的劑量反應。該實驗中，在去除刺激緩沖液后延遲不同時間后加入裂解液—— 5、10或30分鐘。結(jié)果顯示當延遲添加裂解緩沖液時，會對磷酸化ERK的檢測到產(chǎn)生不利影響。

通過上述實用技巧分享希望能夠幫助大家獲得最佳的檢測結(jié)果，磷酸化檢測不僅提供HTRF方案還有Alpha方案，下期再見！