細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法的進展和未來

包含自革蘭氏陰性菌的脂多糖（LPS）在內(nèi)的熱原是可引起發(fā)熱的物質(zhì)，也是醫(yī)藥制品中的有害污染物。當(dāng)醫(yī)藥制品與血液和器官直接接觸時，其可能包含的熱原會激活人體的先天免疫機制，從而可能導(dǎo)致高燒、炎癥、組織損傷、敗血癥和休克。^[1]因此，為了滿足監(jiān)管要求，醫(yī)藥制品需要進行熱原檢測，這也是藥典規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量規(guī)格的一部分。^[1]

◆熱原的歷史背景

1875年，伯頓-桑德森（Burdon-Sanderson）提出了 "熱原"（pyrogen）一詞，用來描述在腐肉的無菌提取物中發(fā)現(xiàn)的一種假設(shè)物質(zhì)，注射后會導(dǎo)致動物發(fā)熱。1911年，韋赫塞爾曼（Wechselman）發(fā)現(xiàn)在注射灑爾佛散（Salvarsan，一種治療梅毒的藥物）時，會因蒸餾水中的細(xì)菌導(dǎo)致患者發(fā)熱，這促使他開始尋找解決方案。然而，灑爾佛散不能口服，只能通過注射起效。因這種注射藥物變得普遍，熱原控制變得至關(guān)重要 ^[2] 。

◆熱原檢測

家兔熱原試驗（RPT)

Hort和Penfeld于1912年進行了家兔熱原試驗，發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌在家兔身上出現(xiàn)明顯的熱原反應(yīng)，而革蘭氏陽性菌的反應(yīng)則輕微得多^[2]。在家兔熱原試驗中，通過給家兔注射熱原并記錄體溫升高的發(fā)熱反應(yīng)。但家兔對熱原的反應(yīng)可能與人體的反應(yīng)具有差異，因此檢測存在一定的局限性。

鱟試驗法（LAL）

鱟試驗法（LAL，也稱鱟阿米巴樣細(xì)胞溶解物檢測法）又稱細(xì)菌內(nèi)毒素檢測法（BET），是一種經(jīng)濟且獲得廣泛認(rèn)可的替代方法。鱟試驗法通過將鱟血液與細(xì)菌內(nèi)毒素混合，最終形成一種凝膠或顯色。目前的鱟試驗法試劑盒通過利用這種裂解物的濁度特性或顯色特性進行檢測。在熱原檢測方面，鱟試驗法的靈敏度已被證明是家兔法的5倍^[3]。

此外，使用氯化鈣溶液對放射性藥物的鱟試驗法進行改良，可避免因螯合劑而導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。具體為螯合劑的存在會降低LAL試劑中游離二價鈣離子的濃度，從而抑制凝固素凝膠的形成，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。目前，美國醫(yī)院和中央放射藥房采用這種改良的LAL檢測法，用于放射性藥物和試劑盒的質(zhì)量控制檢測^[4]。

MAT法（單核細(xì)胞活化試驗）

MAT法（單核細(xì)胞活化試驗）可用于識別和定量內(nèi)毒素和非內(nèi)毒素?zé)嵩?。熱原可激活人體內(nèi)的單核細(xì)胞，從而釋放介質(zhì)^[5]。MAT法通過在體外將人單核細(xì)胞暴露于熱原從而激活單核細(xì)胞，引發(fā)促炎細(xì)胞因子的釋放，隨后可使用ELISA技術(shù)對其進行定量^[6]。MAT法使用人體細(xì)胞，因此更具生理相關(guān)性，可以精確地定量識別和檢測內(nèi)毒素和非內(nèi)毒素?zé)嵩?/span>^[7]。

◆未來展望

從家兔熱原試驗到MAT法的轉(zhuǎn)變充滿挑戰(zhàn)，需要付出巨大的努力。歐洲藥品質(zhì)量管理局、歐洲委員會和歐洲動物試驗替代方法合作組織共同舉辦了 "熱原性試驗的未來：逐步淘汰家兔熱原試驗 "的國際會議，會議重點討論了2026年前從歐洲藥典中刪除家兔熱原試驗、高效推動MAT法應(yīng)用的使命，并指出在淘汰家兔熱原檢測方面還存在的差距^[8]。

此外，為符合FDA指南，使用MAT法前必須執(zhí)行特定于產(chǎn)品的驗證，以確認(rèn)使用MAT法評估特定檢測物質(zhì)或材料的適用性。驗證過程應(yīng)包含對每個樣品進行干擾試驗和精確熱原檢測等多種測試，同時還需要保證設(shè)備與單核細(xì)胞之間的直接接觸^[9]。

參考文獻(xiàn)

1.  Spoladore, J., et al., Standardized pyrogen testing of medical products with the bacterial endotoxin test (BET) as a substitute for 

     rabbit Pyrogen testing (RPT): A scoping review. Toxicol In Vitro, 2021. 74: p. 105160.

2. Hartung, T., The human whole blood pyrogen test – lessons learned in twenty years. ALTEX - Alternatives to animal experimentation, 

    2015. 32(2):p. 79-100.

3.  Karesh, S.M.J.J.o.n.m.t., Sterility and pyrogen testing of radiopharmaceuticals. 1989. 17(3): p. 156-159.

4.  Mitra, A., et al., Limulus amebocyte lysate testing: adapting it for determination of bacterial endotoxin in 99mTc-labeled 

    radiopharmaceuticals at a hospital radiopharmacy. J Nucl Med Technol, 2014. 42(4): p. 278-82.

5.  Solati, S., T. Zhang, and S. Timman, The monocyte activation test detects potentiated cytokine release resulting from the synergistic

     effect of endotoxin and non-endotoxin pyrogens. Innate Immun, 2022. 28(3-4): p. 130-137.

6.  Perdomo-Morales, R., et al., Monocyte activation test (MAT) reliably detects pyrogens in parenteral formulations of human serum

     albumin. Altex, 2011.28(3): p. 227-35.

7.  Carson, D., et al., Development of a Monocyte Activation Test as an Alternative to the Rabbit Pyrogen Test for Mono- and Multi-

    Component Shigella GMMA-Based Vaccines. 2021. 9(7): p. 1375.

8.  Cirefice, G., et al., The future of pyrogenicity testing: Phasing out the rabbit pyrogen test. A meeting report. Biologicals, 2023. 84: p.

    101702.

9. Sandle, T., FDA guidance on pyrogens and endotoxin testing.

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