人眼瞼真皮成纖維細(xì)胞永生化是通過原代細(xì)胞人眼瞼真皮成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)SV40過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建擴(kuò)增至少到12代而成的。

1.試驗(yàn)所需儀器設(shè)備及試劑

（1）儀器

（2）試劑耗材

2.人真皮成纖維細(xì)胞（A）的分離培養(yǎng)

1) 將手術(shù)中取出的組織置于無菌PBS緩沖液中低溫運(yùn)輸，

2) 在超凈工作臺(tái)內(nèi)取出組織，用75%酒精浸泡2min左右，置于含有P/S的PBS中，

3) 將組織塊剪成邊長(zhǎng)約為0.1cm的正方形，反復(fù)清洗后棄上清，置于含有wan全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，37℃孵育30~60min，

4) 用鑷子夾入培養(yǎng)瓶中，倒置于5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2h，

5) 分別加入2ml成纖維細(xì)胞wan全培養(yǎng)基，浸潤(rùn)組織塊，但不能使組織塊漂浮，置于5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，

6) 每隔3天換液，待組織塊周圍生長(zhǎng)的細(xì)胞融合成片，即可去除組織塊， 用胰蛋白酶消化細(xì)胞，重新鋪瓶。

細(xì)胞培養(yǎng)圖片如下：

                              100x                                                   200x

原圖見文件-細(xì)胞培養(yǎng)

3．免疫熒光鑒定

3.1實(shí)驗(yàn)步驟

（1）細(xì)胞爬片

取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培養(yǎng)基1mL，加入細(xì)胞0.02million個(gè)/孔。置培養(yǎng)箱2h或過夜。

（2）固定

細(xì)胞爬片后，吸出培養(yǎng)基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS，放4℃過夜。

（3）破膜封閉

將玻片除去水分，置于培養(yǎng)皿支撐物上，

玻璃片封閉液配置：0.5% Trition X-100與PBS 1:1混合，再加10% 血清，

取50uL破膜封閉液滴于防水膜上，將玻片上有細(xì)胞的一面蓋上2h。

（4）一抗孵育

一抗配制：抗體與PBS 1:100（200）稀釋

破膜封閉后，取50uL一抗于防水膜上（濕盒中），將玻片（有細(xì)胞的一面）蓋上置于4℃（最多可放置一周）

（5）二抗孵育

室溫避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。

（6）包埋

玻片上各滴1滴Fluoromount-G，將有細(xì)胞的一面蓋上。

鑒定細(xì)胞為P1代細(xì)胞

3.2免疫熒光鑒定結(jié)果

              100X-DAPI                                     100X-fluorescence

                200X-DAPI                                 200X-fluorescence

原圖見文件-免疫熒光

4.轉(zhuǎn)染

4.1SV40過表達(dá)慢病毒基本信息

4.2轉(zhuǎn)染

（1）將細(xì)胞接種6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約為1×10^5 個(gè)，

（2）第二天，待細(xì)胞貼壁后，換液，

（3）加入1mLwan全培養(yǎng)基，再加20 μL SV40過表達(dá)慢病毒，

（4）混勻后繼續(xù)培養(yǎng)，

（5）12h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，并更換為新鮮培養(yǎng)基，

（6）當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿板底后，傳代至T25培養(yǎng)瓶中。

5.篩選

5.1殺滅曲線的確定

（1）將未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按每孔0.05million鋪入24孔板，孵育過夜，

（2）第二天，除去24孔板中舊的培養(yǎng)基，

（3）將含不同濃度嘌呤霉素（1ug/mL，2ug/mL，3ug/mL，4ug/mL，5 ug/mL，6ug/mL，7ug/mL）的新鮮培養(yǎng)基加入已鋪有細(xì)胞的24孔板，

（4）每2天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，

（5）每天觀察細(xì)胞的存活比例，

（6）最小的嘌呤霉素使用濃度就是從嘌呤霉素篩選開始1-4d內(nèi)殺死所有細(xì)胞的zui低篩選濃度。

結(jié)果：嘌呤霉素的使用濃度為3ug/mL，作用時(shí)間2d。

5.2嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞

（1）第一天，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按每孔0.05million鋪入24孔板，孵育過夜

（2）第二天，除去24孔板中舊的培養(yǎng)基，

（3）加入含嘌呤霉素（3ug/mL）的篩選培養(yǎng)基，孵育，

（4）每2天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，

（5）每天觀察細(xì)胞的存活比例，

（6）在同一時(shí)間點(diǎn)（2d）存活的細(xì)胞，即為轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，

（7）對(duì)篩選后的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。

6.細(xì)胞擴(kuò)增

將篩選后的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，篩選后的細(xì)胞為P1代，擴(kuò)增至少到12代。

永生化的細(xì)胞圖片如下：

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原圖見文件-永生化