電激法導(dǎo)入外源基因植物基因改造新章

一、引言

在植物基因工程領(lǐng)域，導(dǎo)入外源基因是實現(xiàn)植物性狀改良和功能研究的關(guān)鍵步驟。傳統(tǒng)的基因?qū)敕椒ㄈ甾r(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法等在某些情況下存在局限性，例如農(nóng)桿菌的宿主范圍限制和基因槍轉(zhuǎn)化成本較高等問題。電激法作為一種新興的基因?qū)爰夹g(shù)，為植物基因改造帶來了新的機遇。電激法利用短暫的高壓電脈沖在細胞膜上形成可逆的微孔，從而使外源基因能夠穿過細胞膜進入細胞內(nèi)部。這種方法具有操作相對簡單、不受植物種類限制、可同時處理多個細胞等優(yōu)點，為植物基因改造研究開辟了新的途徑。

二、電激法導(dǎo)入外源基因的原理

（一）細胞膜的電學(xué)性質(zhì)

植物細胞膜具有一定的電容和電阻特性。在正常情況下，細胞膜作為一種半透性屏障，阻止大分子物質(zhì)如外源基因的自由進出。然而，當(dāng)施加高壓電脈沖時，細胞膜兩側(cè)的電位差會發(fā)生急劇變化，導(dǎo)致細胞膜的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

（二）電穿孔現(xiàn)象

高壓電脈沖引起細胞膜脂質(zhì)雙分子層中的疏水區(qū)域重新排列，形成瞬間的、可逆的微孔，這一過程被稱為電穿孔。這些微孔的大小和數(shù)量取決于電脈沖的強度、持續(xù)時間和脈沖次數(shù)等參數(shù)。當(dāng)外源基因存在于細胞周圍的介質(zhì)中時，它們可以通過這些微孔進入細胞內(nèi)部，實現(xiàn)基因的導(dǎo)入。

（三）細胞的恢復(fù)與基因整合

電穿孔形成后，在電脈沖結(jié)束后的短時間內(nèi)，細胞膜具有自我修復(fù)能力，微孔會逐漸閉合。進入細胞內(nèi)的外源基因可以通過細胞內(nèi)的各種機制進行轉(zhuǎn)運和整合到植物基因組中，從而實現(xiàn)基因的穩(wěn)定表達和遺傳。

三、電激法導(dǎo)入外源基因的實驗方法

（一）植物材料的準(zhǔn)備

植物組織的選擇

選擇合適的植物組織對于電激法的成功至關(guān)重要。一般來說，幼嫩的葉片、愈傷組織、懸浮細胞等都是常用的材料。例如，對于雙子葉植物，幼嫩葉片的表皮細胞和葉肉細胞具有較高的再生能力和基因?qū)霛摿Ατ趩巫尤~植物，愈傷組織或懸浮培養(yǎng)細胞可能更有利于基因?qū)牒秃罄m(xù)的培養(yǎng)。

植物材料的預(yù)處理

采集的植物組織需要進行預(yù)處理以提高電激轉(zhuǎn)化效率。對于葉片組織，通常先用無菌水清洗，然后用消毒劑（如次氯酸鈉溶液）進行表面消毒，再用無菌水沖洗干凈。對于愈傷組織和懸浮細胞，需要在合適的培養(yǎng)基中進行預(yù)培養(yǎng)，使其處于活躍的生長狀態(tài)。預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分根據(jù)不同植物種類進行優(yōu)化，一般包括適量的碳源、氮源、無機鹽和植物生長調(diào)節(jié)劑等。

（二）外源基因的準(zhǔn)備

基因載體的構(gòu)建

選擇合適的基因載體來攜帶外源基因。常見的載體包括質(zhì)粒載體，如 pBI121 等。在構(gòu)建載體時，將目的基因（如抗蟲基因、抗病基因或具有特定生理功能的基因）插入到載體的合適位置，同時還需要包含啟動子、終止子等調(diào)控元件。啟動子的選擇對于基因在植物中的表達水平至關(guān)重要，常用的啟動子有 CaMV 35S 啟動子等，它可以在多種植物中驅(qū)動基因的高效表達。

外源基因的純度和濃度

獲得高純度的外源基因是保證電激轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵之一。通過基因克隆、提取和純化等步驟，確?；蛉芤褐袥]有雜質(zhì)。外源基因的濃度也需要進行優(yōu)化，一般在微克每微升級別。濃度過低可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率低下，而濃度過高可能對細胞造成損傷。

（三）電激參數(shù)的優(yōu)化

電脈沖強度

電脈沖強度是影響電穿孔效果的重要因素。一般通過實驗來確定最佳的脈沖強度，通常在幾百伏到幾千伏每厘米的范圍內(nèi)。對于不同的植物材料和細胞類型，合適的脈沖強度有所不同。例如，對于一些薄壁細胞較多的植物組織，較低的脈沖強度可能就足以形成有效的電穿孔，而對于細胞壁較厚或細胞結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的植物材料，可能需要更高的脈沖強度。

脈沖持續(xù)時間和脈沖次數(shù)

脈沖持續(xù)時間通常在微秒到毫秒級別。較短的脈沖持續(xù)時間可能不足以形成足夠大的微孔讓外源基因進入，而過長的持續(xù)時間可能會對細胞造成不可逆的損傷。脈沖次數(shù)一般在 1 - 10 次之間，多次脈沖可以增加電穿孔的效率，但也需要注意避免過度損傷細胞。通過設(shè)計一系列的實驗，改變脈沖持續(xù)時間和脈沖次數(shù)，觀察基因?qū)胄屎图毎婊盥?，來確定最佳的參數(shù)組合。

（四）電激處理過程

電激緩沖液的選擇

選擇合適的電激緩沖液對于維持細胞的生理狀態(tài)和提高基因?qū)胄手陵P(guān)重要。緩沖液的成分一般包括適量的無機鹽（如氯化鈉、氯化鈣等）、緩沖劑（如 HEPES）和糖類（如甘露醇）等。這些成分有助于維持細胞的滲透壓、離子平衡和 pH 值，減少電脈沖對細胞的損傷。

電激操作

將預(yù)處理后的植物組織或細胞與含有外源基因的溶液混合，置于電激杯中。電激杯通常具有兩個電極，將其連接到電激儀上。根據(jù)優(yōu)化好的電脈沖強度、持續(xù)時間和脈沖次數(shù)等參數(shù)，對細胞進行電激處理。在電激過程中，要確保細胞與電極充分接觸，以保證電脈沖能夠均勻地作用于細胞。

（五）電激后處理與篩選

細胞培養(yǎng)與恢復(fù)

電激處理后，將植物組織或細胞轉(zhuǎn)移到合適的恢復(fù)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)?；謴?fù)培養(yǎng)基的成分與預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基相似，但可能需要添加一些促進細胞修復(fù)和生長的物質(zhì)，如氨基酸、維生素等。在恢復(fù)培養(yǎng)過程中，細胞可以修復(fù)電穿孔造成的損傷，同時外源基因有機會整合到植物基因組中。

篩選轉(zhuǎn)化體

為了篩選出成功導(dǎo)入外源基因的植物細胞或組織，需要采用合適的篩選方法。常用的篩選標(biāo)記基因包括抗生素抗性基因或除草劑抗性基因等。在恢復(fù)培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的抗生素或除草劑，只有成功導(dǎo)入含有篩選標(biāo)記基因的外源基因的細胞才能存活和生長。通過連續(xù)的篩選和培養(yǎng)，可以獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物細胞系或再生植株。

四、電激法的優(yōu)勢

（一）廣泛的適用性

電激法不受植物種類的限制，無論是雙子葉植物還是單子葉植物，甚至一些難以用傳統(tǒng)方法轉(zhuǎn)化的植物都可以嘗試使用電激法進行基因?qū)?。這使得電激法在植物基因工程領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用前景，為研究各種植物的基因功能和性狀改良提供了可能。

（二）操作簡便性

相較于一些復(fù)雜的基因?qū)敕椒?，電激法的操作相對簡單。它不需要?fù)雜的生物試劑（如農(nóng)桿菌）或昂貴的設(shè)備（如基因槍），只需要一臺電激儀和基本的實驗室條件即可開展實驗。這降低了實驗成本和技術(shù)門檻，有利于更多的研究人員開展植物基因改造研究。

（三）可同時處理多個細胞

電激法可以同時對大量的細胞進行處理，提高了基因?qū)氲男?。在電激過程中，只要細胞處于合適的電場范圍內(nèi)，都有機會被電穿孔并導(dǎo)入外源基因。這種批量處理能力對于需要大量轉(zhuǎn)基因材料的研究，如基因功能的大規(guī)模篩選等具有重要意義。

五、電激法的挑戰(zhàn)與限制

（一）細胞損傷問題

雖然電穿孔是可逆的，但如果電脈沖參數(shù)設(shè)置不當(dāng)，很容易對細胞造成不可逆的損傷，導(dǎo)致細胞死亡或生長異常。這種損傷不僅會影響基因?qū)胄?，還可能影響后續(xù)轉(zhuǎn)基因植物的生長和發(fā)育。因此，精確優(yōu)化電脈沖參數(shù)對于減少細胞損傷至關(guān)重要。

（二）基因整合的隨機性

外源基因通過電激法導(dǎo)入細胞后，其在植物基因組中的整合位置是隨機的。這種隨機性可能會導(dǎo)致基因表達的不穩(wěn)定性或產(chǎn)生意想不到的基因沉默現(xiàn)象。此外，隨機整合還可能破壞植物原有的基因功能，對植物的生長和發(fā)育產(chǎn)生負面影響。因此，需要進一步研究如何控制外源基因的整合位置和方式。

（三）轉(zhuǎn)化效率的提高

盡管電激法具有一定的優(yōu)勢，但目前其轉(zhuǎn)化效率在某些情況下仍然相對較低，尤其是對于一些復(fù)雜的植物基因組或特定的植物組織。提高轉(zhuǎn)化效率仍然是電激法在植物基因改造中需要解決的關(guān)鍵問題之一，需要從植物材料預(yù)處理、電激參數(shù)優(yōu)化、外源基因載體設(shè)計等多個方面進行深入研究。

六、電激法在植物基因改造中的應(yīng)用前景

（一）作物性狀改良

通過電激法導(dǎo)入抗蟲、抗病、抗逆等相關(guān)基因，可以培育出具有優(yōu)良性狀的農(nóng)作物新品種。例如，將 Bt 抗蟲基因?qū)胨?、玉米等作物中，可以提高作物對害蟲的抵抗力，減少農(nóng)藥的使用，實現(xiàn)綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。同時，導(dǎo)入耐鹽、耐旱等抗逆基因可以使作物在惡劣的環(huán)境條件下生長，擴大作物的種植范圍。

（二）植物功能基因組學(xué)研究

電激法可以用于將報告基因（如 GFP 綠色熒光蛋白基因）導(dǎo)入植物細胞，通過觀察報告基因的表達模式來研究基因的啟動子活性、基因表達的時空特異性等。此外，通過導(dǎo)入功能缺失或過表達的基因，可以分析基因在植物生長、發(fā)育和生理過程中的功能，為植物功能基因組學(xué)研究提供有力的工具。

（三）藥用植物基因工程

對于一些藥用植物，可以利用電激法導(dǎo)入合成藥用成分相關(guān)的基因，提高藥用成分的含量和產(chǎn)量。例如，在人參、丹參等藥用植物中導(dǎo)入相關(guān)基因，有望增加其有效成分的積累，提高藥用價值，為醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)提供更多的優(yōu)質(zhì)原料。

七、結(jié)論

電激法作為一種新興的植物基因?qū)爰夹g(shù)，在植物基因改造領(lǐng)域展現(xiàn)出了更好的優(yōu)勢和巨大的潛力。通過深入研究其原理和優(yōu)化實驗方法，我們可以克服目前面臨的挑戰(zhàn)，進一步提高電激法的轉(zhuǎn)化效率和基因整合的可控性。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，電激法有望在作物性狀改良、植物功能基因組學(xué)研究和藥用植物基因工程等多個領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，開啟植物基因改造的新篇章，為解決全球糧食安全、農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和醫(yī)藥資源等問題提供新的途徑和方法。在未來的研究中，需要多學(xué)科交叉合作，不斷完善電激法技術(shù)體系，推動植物基因工程領(lǐng)域的進一步發(fā)展。