PCR血液標(biāo)本保存方法及注意事項(xiàng)

    最好是用淋巴細(xì)胞分離液把單個(gè)核細(xì)胞分離出來，然后-80℃保存。外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）的分離是免疫學(xué)研究中的一項(xiàng)基本技術(shù)。目前國(guó)內(nèi)外分離PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法（ficoll-hypaque density gradient centrifugation），用此方法分離PBMC純度可達(dá)95％，淋巴細(xì)胞約占90％，其中T淋巴細(xì)胞占80％，B淋巴細(xì)胞占4～10％。ficoll-hypaque混合溶液，又稱淋巴細(xì)胞分層液，在分離人PBMC時(shí)，要求其比重為1.077；分離小鼠單個(gè)核細(xì)胞時(shí)比重為1.080；分離大鼠單個(gè)核細(xì)胞時(shí)比重為1.084～1.087；分離馬單個(gè)核細(xì)胞時(shí)比重為1.090。

原理 ：

血液中各有形成分的比重存在差異，利用比重為1.077、近于等滲的ficoll-hypaque混合溶液（又稱淋巴細(xì)胞分層液）作密度梯度離心時(shí)，各種血液成分將按密度梯度重新聚集。血漿和血小板由于密度較低，故懸浮于分層液的上部；紅細(xì)胞與粒細(xì)胞由于密度較大，故沉于分層液的底部；PBMC密度稍低于分層液，故位于分層液界面上，這樣就可獲得PBMC。

 方法：

1.靜脈取血2ml，加入含肝素溶液(10～50u／m1血樣本)的試管中，混勻，使血液抗

凝。用pH7.2 Hanks液將抗凝血稀釋1倍。

2.吸取2ml淋巴細(xì)胞分層液置于刻度離心管中，然后將離心管傾斜45O角，用毛細(xì)滴管將稀釋的全血沿管壁緩慢加至分離液上面，應(yīng)注意保持兩者界面清晰。

3.在18℃～20℃下，用水平離心機(jī)以2000r/min離心20min。離心后細(xì)胞分布如圖。

 4.用毛細(xì)吸管輕輕插到混濁帶，沿管壁輕輕吸出此層細(xì)胞，移入另一支離心管中。即要吸取所有單個(gè)核細(xì)胞，又要避免吸取過多的分層液或血漿，以免混入其他細(xì)胞成分。

5.用Hanks液洗滌細(xì)胞3次。第一次2000r/min ，10 min；第2～3 次1500r/min ，10 min，可去掉大部分混雜的血小板。

6.將沉淀細(xì)胞懸于培養(yǎng)基中備用。

注意事項(xiàng)：

  1、實(shí)驗(yàn)所用玻璃器皿應(yīng)該潔凈。如果制備的單個(gè)核細(xì)胞懸液用于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，上述操作過程都要在無菌條件下進(jìn)行，所用器材、試劑都應(yīng)為無菌。

 2、實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞得率與室溫及分層液比重等有關(guān)。分層液應(yīng)避光4℃保存。

3、往淋巴細(xì)胞分層液中加入稀釋全血時(shí)，不得將血液沖入分離液中，須保持兩層液體的清晰界面。