使用二維液相色譜分析飼料中的 維生素 A、D3、E

摘要本文介紹了使用二維液相色譜同時(shí)檢測(cè)飼料中維生素 A、D3、E 的分析方法。前處理使用安捷倫表面親水反相苯乙烯二乙烯基苯聚合物 Bond Elut Plexa 對(duì)飼料堿性皂化液進(jìn)行富集和凈化，方法簡單，高效、環(huán)保。在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)，維生素 A、D3、E 的線性相關(guān)系數(shù)均大于 0.999。5 種飼料在不同的加標(biāo)濃度下，維生素 A、D3、E 的平均加標(biāo)回收率分別在 91.9%–112.1%、87.4%–122.9% 和 89.4%–116.7% 之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在1.0%–11.5%、0.2%–10.5% 和 0.9%–9% 之間，準(zhǔn)確度和精密度良好，該方法適用于同時(shí)檢測(cè)飼料中的維生素 A、D3、E。

前言脂溶性維生素 A、D、E 作為一類有機(jī)微量營養(yǎng)物質(zhì)，有促進(jìn)動(dòng)物生長、調(diào)節(jié)代謝和增強(qiáng)動(dòng)物免疫等作用。通常情況下，畜禽不能或難以合成滿足自身需要的足量維生素，因此需要在飼料中添加適量維生素，以滿足養(yǎng)殖業(yè)對(duì)于飼喂畜禽快速、健康生長的需求[1]。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第 2625 號(hào)公告[2] 制定了飼料中維生素的推薦用量和最高用以指導(dǎo)飼料生產(chǎn)企業(yè)根據(jù)畜禽品種和不同生長階段調(diào)控維生素的添加量。根據(jù)現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)，維生素 A、D3、E 的檢測(cè)是分開的三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)[3-5]，檢測(cè)成本較高，耗時(shí)且工作量大。因此，有必要建立一種可以同時(shí)檢測(cè)維生素A、D3、E 的方法，實(shí)現(xiàn)飼料中脂溶性維生素含量的準(zhǔn)確測(cè)定，對(duì)飼料中維生素含量進(jìn)行監(jiān)控，掌控飼料中含量，使其可以既滿足畜禽營養(yǎng)需求，又符合國家規(guī)范要求。飼料中維生素 A、D3、E 的前處理方法，通常包括皂化、提取和濃縮等步驟，皂化的主要目的是將維生素從制劑包被的狀態(tài)中游離出來同時(shí)將酯形式的維生素水解為醇便于檢測(cè)，皂化步驟通常是一步。對(duì)于提取和濃縮，一般有液液萃取和固相萃取兩種方法，傳統(tǒng)的液液萃取方式采用石油醚，相比于液液萃取消耗溶劑量大，環(huán)境不友好，耗時(shí)的缺陷而言，固相萃取具有節(jié)省溶劑，集凈化和濃縮于一體且能實(shí)現(xiàn)良好的凈化效果等優(yōu)勢(shì)。Agilent Bond Elut Plexa SPE 柱，是表面羥基化的聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物填料，易被水潤濕且流速優(yōu)異，可耐受高pH，是比較理想的選擇。對(duì)于儀器方法，維生素 A、E 可使用一維 DAD 檢測(cè)，而維生素 D3 添加量較低，靈敏度有限且易受基質(zhì)干擾，是制約維生素 A、D3、E 同時(shí)檢測(cè)的難點(diǎn)所在。二維液相色譜具有自動(dòng)化程度高且峰容量大，可顯著降低復(fù)雜樣品的基質(zhì)干擾等特點(diǎn)，已得到廣泛的應(yīng)用，安捷倫目前已經(jīng)有多篇關(guān)于食品中維生素 A、D、E 同時(shí)檢測(cè)的應(yīng)用[6-9]，其中包括在線 SPE-2D中心切割法對(duì)皂化液進(jìn)行自動(dòng)凈化，富集，以及維生素 A、D、E 的同時(shí)分析。本文在此基礎(chǔ)上，使用 Agilent Bond Elut Plexa離線固相萃取方式對(duì)皂化液進(jìn)行凈化和富集，并結(jié)合二維液相色譜，建立了同時(shí)檢測(cè)飼料中三種脂溶性維生素 A、D3、E 含量的方法，為用戶提供更多，更靈活的方法選擇。

實(shí)驗(yàn)部分試劑和樣品實(shí)驗(yàn)用乙腈、甲醇均為色譜純，購于北京迪馬科技有限公司；無水乙醇、氫氧化鉀、L-抗壞血酸、二丁基羥基甲苯 (BHT) 為分析純。維生素 A、維生素 A 乙酸酯、維生素 E、維生素 E 乙酸酯和維生素 D3 標(biāo)準(zhǔn)品購于曼哈格公司 (BePure)。飼料樣品為市售產(chǎn)品。標(biāo)準(zhǔn)品制備稱取一定量上述標(biāo)準(zhǔn)品，以甲醇為溶劑，配制于棕色試劑瓶中，密封后避光儲(chǔ)存于 –18 °C 下。臨用前將儲(chǔ)備溶液回溫至室溫，參考國標(biāo)方法進(jìn)行濃度校正。

儀器和設(shè)備儀器具體配置如下：Agilent 1260 Infinity II 泵（第一維泵，部件號(hào) G7111；第二維泵，部件號(hào) G1312B）；Agilent 1260 InfinityII 自動(dòng)進(jìn)樣器（部件號(hào) G7129A）；Agilent 1260 Infinity II 柱溫箱（部件號(hào) G7116A）； Agilent 1260 Infinity II VWD（部件號(hào)G7114B，第一維檢測(cè)器）Agilent 1260 Infinity II DAD 檢測(cè)器（G7117C，第二維檢測(cè)器）。色譜柱采用 Agilent Poroshell HPH-C8（4.6 × 50 mm, 2.7 µm，部件號(hào) 699975-706）、Poroshell 120 EC-C18（4.6 × 5 mm, 2.7 µm，部件號(hào) 820750-911）和 Zorbax Eclipse PAH（2.1 × 100 mm,3.5 μm ，部件號(hào)959793-918）。樣品前處理采用 Agilent Bond Elut Plexa（200 mg，6 mL；部件號(hào)12109206）、Agilent ValueLab 尼龍微孔濾膜（0.2 μm，13 mm；部件號(hào) 5191-4286）。

維生素標(biāo)樣制備準(zhǔn)確取適量維生素 A、D3、E 標(biāo)準(zhǔn)工作液，用乙腈配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中維生素 A 的濃度分別為 0.2、0.5、1、5、10、20、50 IU/mL，維生素 D3 的濃度分別為 0.1、0.5、1、5、10、50 IU/mL，維生素 E 的濃度分別為 0.0005、0.001、0.005、0.05、0.1、0.2、0.5 IU/mL，臨用現(xiàn)配。

樣品前處理稱取一定量飼料樣品，加入乙醇和氫氧化鉀溶液皂化后使用Agilent Bond Elut Plexa 固相萃取柱對(duì)皂化液中維生素 A、D3、E進(jìn)行富集和凈化，用二維液相色譜測(cè)定，如圖 1 所示為樣品前處理操作流程，表 1 所示為液相色譜分析條件。

結(jié)果與討論Bond Elut Plexa 固相萃取條件優(yōu)化Agilent Bond Elut Plexa 固相萃取柱，是表面羥基化的聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物填料，能夠耐受皂化液的強(qiáng)堿條件，易被水潤濕且流速佳，適合飼料皂化液中富集和凈化維生素 A、D3、E。為了確定最佳的固相萃取條件，本應(yīng)用從淋洗溶劑（5%、10%、20%、40%、50% 甲醇水）、洗脫溶劑（乙腈、甲醇、乙酸乙酯）和洗脫體積（2 mL、3 mL、4 mL）三個(gè)方面對(duì)固相萃取條件進(jìn)行優(yōu)化。采用飼料皂化液加入適量的維生素 A、D3、E 標(biāo)樣的方法，分別采用上述不同的淋洗溶劑、洗脫溶劑和洗脫體積做相應(yīng)的處理（在確定最佳的條件之前，均使用 10% 甲醇水淋洗和4 mL 乙腈洗脫的條件），結(jié)果分別見圖 2A、2B。由圖可知，使用不同的淋洗溶劑，回收率結(jié)果沒有明顯差異，但考慮到上樣皂化液中含有高濃度的氫氧化鉀溶液，采用高比例水淋洗有更佳的去除效果，因此選擇 10% 甲醇水溶液作為淋洗溶液。對(duì)于不同的洗脫溶劑，乙腈對(duì)維生素 A、D3、E 的洗脫效果優(yōu)于甲醇和乙酸乙酯。因此進(jìn)一步比較確定了乙腈的使用量，使用 3 mL 即可將維生素 A、D3、E 洗脫，最終確定了使用 10% 甲醇水淋洗，并使用 3 mL 乙腈洗脫。