通過(guò)空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細(xì)胞多組學(xué)分析揭示人類胸腺細(xì)胞的空間組織和發(fā)育

各位讀者好，今天為大家解讀的文獻(xiàn)是由浙江大學(xué)邵逸夫醫(yī)院團(tuán)隊(duì)、安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院團(tuán)隊(duì)、南京鼓樓醫(yī)院團(tuán)隊(duì)聯(lián)合北京中日友好醫(yī)院團(tuán)隊(duì)在Nature Communications發(fā)表的，題為“Unraveling the spatial organization and development of human thymocytes through integration of spatial transcriptomics and single-cell multi-omics profiling”。

人類胸腺細(xì)胞（thymocytes）的發(fā)育和空間組織是免疫學(xué)研究的重要領(lǐng)域，對(duì)于理解T細(xì)胞成熟和免疫功能至關(guān)重要。當(dāng)前，研究者們主要通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析來(lái)研究胸腺細(xì)胞的發(fā)育，但這些方法無(wú)法提供細(xì)胞的空間信息，限制了對(duì)胸腺微環(huán)境和細(xì)胞間相互作用的深入理解。

盡管單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為胸腺細(xì)胞的研究提供了新的視角，但如何將這些高維數(shù)據(jù)與細(xì)胞的空間位置信息相結(jié)合，仍是一個(gè)技術(shù)挑戰(zhàn)。此外，胸腺細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞間通訊和微環(huán)境影響因素的識(shí)別也是研究中的難點(diǎn)，需要更精細(xì)的空間分辨率和多維度數(shù)據(jù)整合方法來(lái)克服。

本研究通過(guò)整合空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細(xì)胞多組學(xué)分析，深入探究了人胸腺細(xì)胞的空間組織和發(fā)育過(guò)程。研究揭示了T細(xì)胞發(fā)育、空間組織在單細(xì)胞分辨率下的動(dòng)態(tài)變化，以及與T細(xì)胞成熟相關(guān)的TCR信號(hào)傳導(dǎo)變化，為理解基礎(chǔ)免疫機(jī)制和潛在的臨床應(yīng)用提供了寶貴的見(jiàn)解和數(shù)據(jù)資源。

空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細(xì)胞多組學(xué)結(jié)合應(yīng)用已在眾多研究領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。上海達(dá)為科可開(kāi)展空間轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞多組學(xué)結(jié)果分析與解讀，進(jìn)行相關(guān)分子對(duì)接、蛋白互作靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，繼而開(kāi)展后續(xù)相關(guān)研究。

Fig.1a研究設(shè)計(jì)示意圖

研究框架：

1.研究問(wèn)題：

    文章旨在探索人類胸腺細(xì)胞的空間分布和發(fā)育軌跡，以及不同胸腺細(xì)胞亞群之間的相互作用。

2.研究方法：

    利用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)（ST）和單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)胸腺組織進(jìn)行分析。

    采用CellChat工具評(píng)估胸腺細(xì)胞亞群間的相互作用。

    利用Seurat的AddModuleScore函數(shù)和Monocle2進(jìn)行細(xì)胞亞群的相對(duì)距離評(píng)估和軌跡分析。

    應(yīng)用GO富集分析和擴(kuò)散圖譜分析來(lái)探究T細(xì)胞亞群的功能和發(fā)育軌跡。

3.數(shù)據(jù)分析：

    對(duì)胸腺細(xì)胞的空間分布進(jìn)行聚類和區(qū)域劃分，確定髓質(zhì)和皮質(zhì)區(qū)域。

    通過(guò)廣義線性高斯模型分析細(xì)胞類型隨空間距離的變化。

    識(shí)別與空間距離顯著相關(guān)的基因（DVGs）。

4.結(jié)論：

    揭示了胸腺T細(xì)胞發(fā)育的基本結(jié)構(gòu)單元——胸腺小葉的精確分割。

    描述了不同T細(xì)胞亞群相對(duì)于髓質(zhì)中心的空間分布。

    通過(guò)GO分析和軌跡分析，深入理解了T細(xì)胞亞群的功能特性和發(fā)育路徑。

    文章通過(guò)綜合分析，為理解人類胸腺細(xì)胞的發(fā)育和功能提供了新的視角，并為胸腺相關(guān)疾病的研究提供了潛在的生物標(biāo)志物。

結(jié)果解析：

研究者通過(guò)對(duì)16個(gè)不同發(fā)育階段的胸腺樣本包括產(chǎn)前（4個(gè)樣本）、兒童（8個(gè)樣本）、成人（2個(gè)樣本）和老年（2個(gè)樣本）階段進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）分析，揭示了不同細(xì)胞亞群在胸腺中的發(fā)育軌跡?？偨Y(jié)樣本信息后經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制、整合、主成分分析（PCA）和無(wú)監(jiān)督聚類，利用典型標(biāo)記，將聚集的細(xì)胞預(yù)先注釋為六大譜系，并對(duì)B細(xì)胞、髓系細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和T細(xì)胞進(jìn)行第二輪聚類，共劃分為34種不同的細(xì)胞亞型。后續(xù)發(fā)現(xiàn)，未成熟的T細(xì)胞亞群，如雙陰性細(xì)胞（DN_early, DN_blast）與年齡呈拮抗關(guān)系，在產(chǎn)前階段最為豐富，而部分成熟的T細(xì)胞（如CD4+ T記憶細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）在成人和老年群體中更為豐富。這些結(jié)果表明，胸腺的纖維化和老化影響了T細(xì)胞的發(fā)育，并與胸腺內(nèi)細(xì)胞類型的空間分布變化有關(guān)。

通常，T 細(xì)胞發(fā)育和成熟沿著胸腺小葉內(nèi)的 C-MC-M 軸發(fā)生（C：皮質(zhì)區(qū)域；M：髓質(zhì)區(qū)域；MC：髓質(zhì)-皮質(zhì)邊界）。為了準(zhǔn)確識(shí)別這些區(qū)域進(jìn)而深入了解不同細(xì)胞類型在 T 細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)揮的作用。研究者開(kāi)發(fā)了 TSO-his算法對(duì)胸腺切片進(jìn)行空間分區(qū)的結(jié)果，揭示了不同細(xì)胞類型在皮質(zhì)-髓質(zhì)（C-MC-M）軸上的空間分布。結(jié)果顯示，未成熟的T細(xì)胞（如DN_early和DP_blast）主要集中在皮質(zhì)區(qū)，而成熟的T細(xì)胞（如CD4+ T和CD8+ T細(xì)胞）則集中在髓質(zhì)區(qū)。此外，基質(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞（Fb）和內(nèi)皮細(xì)胞（Endo）在髓質(zhì)區(qū)富集，表明這些細(xì)胞類型在調(diào)控T細(xì)胞發(fā)育中的重要作用。

通過(guò)分析八例胸腺樣本，研究者共識(shí)別出1885個(gè)顯著差異表達(dá)基因，這些基因在皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)域表現(xiàn)出不同的空間分布特征。通過(guò)對(duì)胸腺不同解剖區(qū)域中顯著差異表達(dá)的基因（DVGs）的空間分布及其功能富集分析，進(jìn)一步揭示了其在T細(xì)胞選擇和發(fā)育中的功能。后續(xù)研究者使用TSO-his確定了前五個(gè)在皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)域顯著上調(diào)的基因，如CCL19和CCR7。CCL19是髓質(zhì)中zui顯著上調(diào)的基因，并在mTECs中特異性表達(dá)，而其配體CCR7在成熟T細(xì)胞中高水平表達(dá)，這些基因協(xié)同作用促進(jìn)了成熟T細(xì)胞從胸腺遷移至外周。此外，ELOVL4和CD99的表達(dá)在皮質(zhì)區(qū)顯著升高，特別是在DP階段，表明其在雙陽(yáng)性T細(xì)胞的TCRα鏈重排和陽(yáng)性選擇過(guò)程中具有關(guān)鍵作用。

緊接著研究者分析揭示了在雙陽(yáng)性重排（DP_re）階段，ELOVL4和CD99基因表達(dá)的富集，并且這與它們相應(yīng)的RNA表達(dá)譜結(jié)果一致。通過(guò)小鼠的基因敲除實(shí)驗(yàn)，研究者發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，ELOVL4缺失導(dǎo)致CD4+ T細(xì)胞數(shù)量顯著減少，并且有趣的是，ELOVL4的缺乏導(dǎo)致細(xì)胞因子(包括白細(xì)胞介素2 (IL-2)和干擾素-γ (IFN-γ))的產(chǎn)生減少，同時(shí)在受TCR + CD28刺激的這些T細(xì)胞的增殖能力受到抑制。相比之下，這一現(xiàn)象在CD99-KO骨髓中未觀察到，表明ELOVL4在CD4+ T細(xì)胞發(fā)育中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為生命科學(xué)研究中的重要載體之一，在很多領(lǐng)域的科學(xué)研究中，充當(dāng)著非常重要的安全試驗(yàn)、效果試驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)的角色，尤其在藥物有效性和安全性評(píng)價(jià)中發(fā)揮著不可huo缺的作用。

達(dá)為科生物投資建立的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，擁有清潔級(jí)、SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，面積約1800平米，中心員工包括獸醫(yī)、技術(shù)員和動(dòng)物飼養(yǎng)員，所有員工擁有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上崗證，有著深厚的專業(yè)背景和豐富的實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)，可獨(dú)立開(kāi)展包括大小鼠、裸鼠、豚鼠、兔、比格犬、羊、小型豬等常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的動(dòng)物飼養(yǎng)、造模及相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

    接下來(lái)研究者通過(guò)TSO-hismap工具，將scRNA-seq數(shù)據(jù)精確映射到空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)坐標(biāo)，生成胸腺的單細(xì)胞分辨率空間圖譜。并且與其他工具（如Seurat坐標(biāo)轉(zhuǎn)換(SrtCT)、CellTrek和CARD）相比，發(fā)現(xiàn)TSO-hismap在區(qū)分皮質(zhì)和髓質(zhì)細(xì)胞類型方面表現(xiàn)出更高的精確性。同時(shí)進(jìn)一步測(cè)量了不同細(xì)胞類型與髓質(zhì)中心的相對(duì)距離，揭示了未成熟T細(xì)胞（如DP_blast）主要集中在皮質(zhì)區(qū)，而成熟T細(xì)胞和mTEC則在髓質(zhì)區(qū)富集。這些結(jié)果表明，TSO-hismap工具能夠準(zhǔn)確捕捉胸腺中不同細(xì)胞類型的空間分布，并揭示其在T細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵作用。

后續(xù)研究者通過(guò)使用TSO-hismap以單細(xì)胞分辨率分割斑點(diǎn)來(lái)評(píng)估不同細(xì)胞類型的共定位程度。首先展示了 cTECs高度集中在近端皮質(zhì)-髓質(zhì)交界處和血管周?chē)?，并與某些DP_re細(xì)胞強(qiáng)烈共定位。還觀察到Fb細(xì)胞富集在血管周?chē)钠べ|(zhì)區(qū)域，并與cTEC共定位。這一發(fā)現(xiàn)提供了它們參與T細(xì)胞分化的潛在證據(jù)。同時(shí)，在髓區(qū)觀察到mTEC與CD 4 + T和CD 8 + T細(xì)胞的強(qiáng)共定位。另外，CD 8aa細(xì)胞在髓質(zhì)-皮質(zhì)邊界附近富集，還顯示出與記憶細(xì)胞以及Mono細(xì)胞的顯著共定位。同時(shí)免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)了這些細(xì)胞的共存，然而，這些細(xì)胞與CD8aa細(xì)胞之間相互作用的性質(zhì)仍不清楚，需要進(jìn)一步探索。此外研究者還展示了從遠(yuǎn)端皮質(zhì)到內(nèi)部髓質(zhì)，人類T細(xì)胞發(fā)育不同階段的胸腺細(xì)胞類型的空間共定位示意圖。

接下來(lái)研究者使用了常規(guī)標(biāo)記基因繪制不同階段的細(xì)胞類型來(lái)重建T細(xì)胞的發(fā)育路線。通過(guò)結(jié)合胸腺TCR-seq、scRNA-seq和ST-seq數(shù)據(jù)觀察到TCR克隆大小≥3的T細(xì)胞通常富集在髓質(zhì)區(qū)域，而克隆大小為1的T細(xì)胞主要在皮質(zhì)區(qū)域。并且揭示了四種占優(yōu)勢(shì)的TCRγ-T細(xì)胞亞群，同時(shí)使用單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析證實(shí)了這四個(gè)T細(xì)胞亞群的存在。然后研究者使用TSO-Hismap追蹤胸腺ST切片上四個(gè)T細(xì)胞亞群的空間定位，顯示了從遠(yuǎn)端皮質(zhì)到髓質(zhì)中心點(diǎn)的四個(gè)T細(xì)胞亞群的定位趨勢(shì)，測(cè)量了四種T細(xì)胞亞群的代表區(qū)域到髓質(zhì)中心的距離。進(jìn)一步還分析了每個(gè)亞組的六個(gè)zui顯著富集的生物過(guò)程以及不同年齡組的四種T細(xì)胞亞群豐度的動(dòng)態(tài)變化。這些結(jié)果對(duì)了解其生物學(xué)過(guò)程和發(fā)育特征具有很高的價(jià)值。

鑒于T細(xì)胞發(fā)育與TCR庫(kù)以及TCR多樣性之間的密切關(guān)系，研究者觀察到TCRα和TCRβ鏈的四種T細(xì)胞亞群中VJ基因表達(dá)的明顯偏差，并且展示了VJ基因在四種T細(xì)胞亞群中的偏好性。由于αβ T細(xì)胞成熟是一個(gè)跨越多個(gè)中間狀態(tài)的連續(xù)分化過(guò)程，研究者基于RNA速度，特別是TRAV基因的特征評(píng)分，將DP_re細(xì)胞重新聚類為4個(gè)亞組進(jìn)行分析。為了更系統(tǒng)地了解αβT細(xì)胞的分化模式，對(duì)所有T細(xì)胞進(jìn)行了偽時(shí)間分析，分析了在T細(xì)胞分化偽時(shí)間內(nèi)的代表性基因并且展示了不同階段T細(xì)胞數(shù)量的累積分布曲線。隨后，努力追蹤這些克隆細(xì)胞的命運(yùn)，揭示了這些細(xì)胞在各階段du特而連貫的發(fā)育軌跡。最后總結(jié)了四種T細(xì)胞亞群的發(fā)育時(shí)間和特征，以描述αβ T細(xì)胞的發(fā)育。

研究結(jié)論：

    本研究通過(guò)整合空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細(xì)胞多組學(xué)分析，揭示了人類胸腺細(xì)胞的空間組織和發(fā)育過(guò)程。研究者開(kāi)發(fā)了TSO-his算法來(lái)確定胸腺切片中的髓質(zhì)-皮質(zhì)區(qū)域，劃分胸腺小葉，并測(cè)量基因表達(dá)或細(xì)胞豐度隨空間距離的變化。通過(guò)這種方法，研究人員能夠精確地描繪出胸腺小葉的結(jié)構(gòu)單元，并觀察到胸腺細(xì)胞類型簽名分?jǐn)?shù)隨空間距離的動(dòng)態(tài)變化。此外，研究還識(shí)別了與空間距離顯著共變的基因（DVGs），并利用CellChat工具分析了胸腺細(xì)胞亞群間的細(xì)胞間通信。這些發(fā)現(xiàn)為理解胸腺細(xì)胞的發(fā)育和功能提供了新的視角。

研究的創(chuàng)新性：

    本研究的創(chuàng)新性體現(xiàn)在幾個(gè)方面：首先，研究者開(kāi)發(fā)了TSO-his算法，這是一種新的方法，可以精確地在空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)切片中確定髓質(zhì)和皮質(zhì)區(qū)域，以及劃分胸腺小葉。其次，該研究整合了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細(xì)胞多組學(xué)數(shù)據(jù)，提供了胸腺細(xì)胞發(fā)育的全面視圖。最后，研究不僅識(shí)別了與空間距離顯著共變的基因，還分析了胸腺細(xì)胞亞群間的細(xì)胞間通信，這為理解胸腺細(xì)胞的復(fù)雜相互作用提供了新的工具和數(shù)據(jù)。

研究的不足之處：

    文章中并未明確指出研究的不足之處，但根據(jù)研究?jī)?nèi)容推測(cè)，可能的不足包括：樣本數(shù)量可能有限，這可能影響結(jié)果的普適性；研究主要依賴于算法和計(jì)算模型，可能需要更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證來(lái)支持算法的準(zhǔn)確性；此外，研究主要集中在胸腺細(xì)胞的空間組織和發(fā)育，對(duì)于胸腺細(xì)胞功能和免疫應(yīng)答的深入機(jī)制探討可能不足，未來(lái)研究可以進(jìn)一步探索這些方面。

研究展望：

    后續(xù)可能的研究方向包括：擴(kuò)大樣本量，以增強(qiáng)研究結(jié)果的統(tǒng)計(jì)力和普適性；進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以確認(rèn)TSO-his算法的準(zhǔn)確性和可靠性；深入探討胸腺細(xì)胞的功能和免疫應(yīng)答機(jī)制，特別是在不同疾病狀態(tài)下胸腺細(xì)胞的作用；此外，可以探索胸腺細(xì)胞亞群間的細(xì)胞間通信在免疫發(fā)育中的具體作用，以及這些通信如何影響胸腺細(xì)胞的成熟和分化。

研究意義：

    本研究的理論意義在于提供了一種新的方法來(lái)分析胸腺細(xì)胞的空間組織和發(fā)育，這對(duì)于理解胸腺的免疫功能和胸腺細(xì)胞的成熟過(guò)程至關(guān)重要。實(shí)踐意義方面，這些發(fā)現(xiàn)有助于開(kāi)發(fā)新的免疫治療方法，尤其是在胸腺相關(guān)疾病和免疫缺陷的治療中。此外，通過(guò)揭示胸腺細(xì)胞亞群間的通信網(wǎng)絡(luò)，本研究為設(shè)計(jì)針對(duì)特定免疫細(xì)胞的靶向治療策略提供了理論基礎(chǔ)。