文獻(xiàn)丨Hypoxyprobe Omni Kit試劑盒的實驗探討方案

在癌癥研究中，非侵入性功能成像已成為評估腫瘤發(fā)展和治療效果的重要工具。腫瘤缺氧與腫瘤的侵襲性和預(yù)后密切相關(guān)，是監(jiān)測癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵參數(shù)之一。近年來，光聲（Photoacoustic, PA）成像技術(shù)因其能夠結(jié)合高頻率超聲（Ultrasound, US）實現(xiàn)解剖學(xué)和功能性信息的并行收集，逐漸在臨床前研究中展現(xiàn)出應(yīng)用潛力。光聲成像通過激光脈沖激發(fā)分子產(chǎn)生熱彈性波，這些波可以被超聲接收器檢測，從而實現(xiàn)對深層組織內(nèi)光吸收分子的高分辨率成像。

艾美捷Hypoxyprobe Omni Kit試劑盒（HP3）的應(yīng)用：

在實驗中，為了可視化缺氧區(qū)域，研究團(tuán)隊使用了Hypoxyprobe?-1 Omni試劑盒（Hypoxyprobe Inc.生產(chǎn)，貨號：HP3）。該試劑盒包含Pimonidazole HCl和親和純化的兔抗Pimonidazole抗體（PAb2627AP）。Pimonidazole是一種乏氧細(xì)胞標(biāo)記物，能夠在缺氧條件下與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合，形成穩(wěn)定的加合物。通過腹腔注射Pimonidazole后，可以使用PAb2627AP抗體進(jìn)行免疫組化染色，從而可視化組織中的缺氧區(qū)域。

解析文章《Real-Time Assessment of Tissue Hypoxia In Vivo with Combined Photoacoustics and High-Frequency Ultrasound》

作者：

Marco Gerling 1* , Ying Zhao 2,3* , Salvatore Nania 3 , K. Jessica Norberg 3 , Caroline S. Verbeke 4 , Benjamin Englert 1 , Raoul V. Kuiper 6 , ?sa Bergstr?m 1 , Moustapha Hassan 5 , Albrecht Neesse 7 , J. Matthias L?hr 1,3 , Rainer L. Heuchel 1,3 *

具體實驗步驟：

腫瘤模型建立：研究團(tuán)隊使用了小鼠胰腺癌（KPC細(xì)胞系）和結(jié)腸癌（通過AOM和DSS誘導(dǎo)）模型。

成像與數(shù)據(jù)采集：使用VisualSonics Vevo 2100 LAZR成像系統(tǒng)對小鼠進(jìn)行PA和B模式US成像。在PA成像中，采用750 nm和850 nm的雙波長激光脈沖，測量氧合血紅蛋白（HbO?）和脫氧血紅蛋白（Hb）的濃度，進(jìn)而計算組織氧飽和度（sO?）。在成像前，通過腹腔注射Pimonidazole，隨后在成像后進(jìn)行免疫組化分析，以驗證PA成像結(jié)果的準(zhǔn)確性。

免疫組化分析：切除腫瘤組織，用4%甲醛固定過夜，并進(jìn)行石蠟包埋切片。

使用PAb2627AP抗體進(jìn)行免疫組化染色，檢測Pimonidazole與缺氧細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的加合物。使用ImageJ軟件量化棕色染色強度，以評估缺氧程度。

實驗結(jié)果：

實時光聲成像檢測小鼠器官氧合度變化

通過改變小鼠的氧氣供應(yīng)，研究團(tuán)隊證明了PA系統(tǒng)能夠?qū)崟r檢測組織氧合度的變化。當(dāng)氧氣供應(yīng)從醫(yī)用空氣（21% O?）增加到純氧（100% O?）時，PA成像顯示肝臟實質(zhì)和胃壁的氧合度均有所增加，且肝臟實質(zhì)的氧合度增加更為迅速和顯著。當(dāng)氧氣供應(yīng)恢復(fù)到醫(yī)用空氣時，氧合度也隨之恢復(fù)正常。

腫瘤缺氧檢測及與組織學(xué)評估的相關(guān)性

在胰腺癌和結(jié)腸癌模型中，PA成像能夠準(zhǔn)確識別缺氧區(qū)域，并與免疫組化染色結(jié)果高度一致。例如，在胰腺癌模型中，PA成像能夠清晰顯示腫瘤內(nèi)的缺氧區(qū)域，而免疫組化染色也證實了這些區(qū)域的缺氧狀態(tài)。通過線性回歸分析，研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)PA測量的氧飽和度與Pimonidazole染色強度之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（r=0.91, p=0.0028）。

光聲成像與靜脈造影的互補性

為了評估腫瘤灌注情況，研究團(tuán)隊在PA成像的基礎(chǔ)上結(jié)合了靜脈造影。通過靜脈注射微泡造影劑，并實時跟蹤其在腫瘤內(nèi)的分布和清除情況，研究團(tuán)隊能夠同時獲取腫瘤的氧合度、灌注情況和解剖結(jié)構(gòu)信息。這種雙模態(tài)成像方法為縱向?qū)崟r監(jiān)測腫瘤血管生成和治療反應(yīng)提供了有力的工具。

胰腺皮下腫瘤異種移植物腫瘤缺氧的評價。A)缺氧s.c腫瘤的典型氧-血紅蛋白PA圖像。b模式圖像（左圖）和氧飽和度圖（氧- hemo PA成像，右圖）并排放置，顯示相同的成像窗口。熱圖表示氧飽和度水平，范圍從100%（紅色）到0%（深藍(lán)色）。低于總Hb定義閾值（最大強度的20%）的斑點為黑色（見方法）。黃線代表腫瘤區(qū)域。B)同一s.c.腫瘤的代表性缺氧染色（棕色）。黑線表示腫瘤區(qū)域。C)圖2A所示缺氧s.c腫瘤的代表性H&E染色。D)非缺氧性s.c腫瘤的典型氧血紅蛋白圖像。b模式圖像和氧飽和度圖

（氧合血紅光聲圖像放置在右側(cè)顯示相同的成像窗口）。熱圖如上所示。黃線代表腫瘤區(qū)域。E)非缺氧s.c腫瘤的代表性吡莫硝唑染色，因此缺乏棕色染色，如圖2D所示。黑線表示腫瘤區(qū)域。F)具有代表性的非缺氧性sc腫瘤的H&E染色。G)基于pa的so2測量和相應(yīng)的吡硝唑染色強度線性回歸分析的圖形表示。將吡莫硝唑強度歸一化，將數(shù)據(jù)集中的最高值調(diào)整為100，將z低強度設(shè)置為0。95%置信區(qū)間的置信帶如圖（虛線）所示。

結(jié)論：

本研究表明，雙波長PA成像技術(shù)能夠?qū)崟r、可靠地檢測小鼠腫瘤模型中的缺氧區(qū)域，并與免疫組化結(jié)果高度一致。通過結(jié)合B模式US和靜脈造影技術(shù)，該方法還能夠提供關(guān)于腫瘤灌注和解剖結(jié)構(gòu)的詳細(xì)信息。因此，雙模態(tài)PA/US成像技術(shù)在臨床前癌癥研究中具有廣泛的應(yīng)用前景，可用于實時監(jiān)測腫瘤生長和治療反應(yīng)。