PCR擴(kuò)增反應(yīng)中的嵌合體是什么？

PCR嵌合體(Chimeric Products)：PCR擴(kuò)增反應(yīng)中的嵌合體是指一個(gè)PCR產(chǎn)物來(lái)自?xún)蓚€(gè)或多個(gè)模板分子，通常是由于延伸未完quan導(dǎo)致的?。這種現(xiàn)象通常發(fā)生在PCR反應(yīng)中，特別是當(dāng)使用多重PCR或復(fù)雜模板時(shí)。嵌合體會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物中含有非預(yù)期的片段，有可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，甚至導(dǎo)致錯(cuò)誤的解釋。

在PCR反應(yīng)中，DNA模板在高溫下解旋成單鏈，然后在低溫下引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合。當(dāng)DNA聚合酶在延伸階段未能wanquan復(fù)制某個(gè)序列時(shí)，該部分序列在下一輪PCR反應(yīng)中作為引物繼續(xù)延伸，從而與其他序列混合，形成嵌合體序列?。具體來(lái)說(shuō)，DNA聚合酶在擴(kuò)增某一片段時(shí)，可能會(huì)在模板鏈的某個(gè)位置發(fā)生“跳躍”，將一個(gè)模板DNA片段與另一個(gè)模板片段拼接，從而生成嵌合體產(chǎn)物。嵌合體可以通過(guò)多種機(jī)制形成，但大多數(shù)嵌合體被認(rèn)為是由于擴(kuò)增不完整而引起的

常見(jiàn)的情況有以下三種：

在PCR中，如果存在多個(gè)不同的模板DNA，它們的片段可能在擴(kuò)增過(guò)程中偶然地組合在一起。具

引物二聚體是引物分子自我結(jié)合形成的二聚體。如果PCR引物設(shè)計(jì)不當(dāng)，或者引物濃度過(guò)高，可能會(huì)導(dǎo)致引物二聚體的產(chǎn)生，這些二聚體可能會(huì)參與擴(kuò)增過(guò)程，導(dǎo)致非特異性的擴(kuò)增。在某些情況下，DNA聚合酶在復(fù)制錯(cuò)誤的引物二聚體或非特異性產(chǎn)物時(shí)，也可能會(huì)形成嵌合體。

DNA聚合酶在延伸過(guò)程中，有時(shí)會(huì)發(fā)生“跳躍”或“滑移”，從一個(gè)模板區(qū)域轉(zhuǎn)移到另一個(gè)模板區(qū)域，這種現(xiàn)象通常發(fā)生在復(fù)雜的、含有重復(fù)序列或相似序列的區(qū)域。例如，如果模板中存在相似的序列(常見(jiàn)的擴(kuò)增子測(cè)序)，聚合酶可能會(huì)錯(cuò)誤地“切換”到另一條模板鏈，導(dǎo)致不同片段的連接，從而產(chǎn)生嵌合體。

總結(jié)：

通常在PCR過(guò)程中，大概有1%的幾率會(huì)出現(xiàn)嵌合體序列，而以在16S/18S/ITS 擴(kuò)增子測(cè)序的分析中，系統(tǒng)相似度很高，當(dāng)擴(kuò)增相似序列時(shí)，嵌合體可達(dá)1%-20%，需要去除嵌合體序列。

嵌合體的比例與PCR循環(huán)數(shù)相關(guān)，循環(huán)數(shù)越高，嵌合體比例越高。

• 使用純凈、單一來(lái)源的模板，避免多重模板

• 優(yōu)化引物設(shè)計(jì)，確保引物特異性，避免引物二聚體產(chǎn)生

• 降低PCR反應(yīng)溫度和優(yōu)化擴(kuò)增條件

• 減少PCR循環(huán)次數(shù)

• 使用高保真(High-Fidelity)DNA聚合酶

• 使用有限的DNA模版量

怎么判斷你的PCR產(chǎn)物中有沒(méi)有嵌合體呢？可以使用以下方法進(jìn)行檢測(cè)：

凝膠電泳：通過(guò)凝膠電泳查看PCR產(chǎn)物的大小和模式，若出現(xiàn)多個(gè)不一致的條帶或意外的遷移模式，可能意味著嵌合體的存在。

測(cè)序：對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序。通過(guò)對(duì)比測(cè)序結(jié)果與預(yù)期的目標(biāo)序列，可以檢測(cè)到嵌合體的存在，并分析嵌合體的組成。

限制性酶切分析：如果知道嵌合體的可能位置，可以使用限制性?xún)?nèi)切酶切割PCR產(chǎn)物，分析切割結(jié)果是否符合預(yù)期。（如需凝膠電泳產(chǎn)品，NEB PaqCI限制性?xún)?nèi)切酶、測(cè)序試劑盒，請(qǐng)聯(lián)系天津益元利康生物科技有限公司）