DC細(xì)胞培養(yǎng)攻略

一、概述

1973年，美國(guó)Rockeller大學(xué)Steinmen和Cohn首先從小鼠脾細(xì)胞的分離中發(fā)現(xiàn)了表面具有很多樹(shù)枝狀的突起的細(xì)胞，將其命名為：樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）。DC細(xì)胞作為免疫前線的指揮官，是目前所知的機(jī)體內(nèi)功能max的抗原提呈細(xì)胞，一個(gè)DC細(xì)胞能夠激活100-3000個(gè)T細(xì)胞，是巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞的100-1000倍^[1]。DC細(xì)胞通過(guò)處理腫瘤抗原并將其呈遞給T細(xì)胞，將先天性免疫與適應(yīng)性免疫聯(lián)系起來(lái)，從而啟動(dòng)抗腫瘤免疫，因此DC細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中具有特殊的地位。

1、DC細(xì)胞來(lái)源

DC細(xì)胞是起源于骨髓并居住在外周和淋巴組織中的淋巴樣或髓系細(xì)胞。大多數(shù)DC由共同DC祖細(xì)胞(CDP)生成，CDP在FLT3L誘導(dǎo)下最終生成為cDC和pDC；一部分也會(huì)來(lái)源于造血干細(xì)胞的單核細(xì)胞，在GM-CSF和IL-4的誘導(dǎo)下產(chǎn)生外周血單核細(xì)胞來(lái)源DC^[2]。

所以體外培養(yǎng)的DC細(xì)胞來(lái)源可以是骨髓、外周血的單核細(xì)胞誘導(dǎo)生成；或骨髓、外周血來(lái)源的CD34+HSC骨髓多能造血干細(xì)胞誘導(dǎo)生成；或從血液、組織等樣本中直接分離。其中，外周血中CD14+單核細(xì)胞獲取較為便捷，誘導(dǎo)生成Mo-DC細(xì)胞是很經(jīng)典的方法，不過(guò)Mo-DC無(wú)法再循環(huán)至淋巴結(jié)，并且與淋巴組織駐留樹(shù)突狀細(xì)胞(LT-DC) 存在差異^[3]；CD34+HSC細(xì)胞不太容易獲取，但可以誘導(dǎo)生成pDC、cDC1和cDC2；而直接從樣本中分離獲得的DC細(xì)胞很接近體內(nèi)真實(shí)情況，不過(guò)產(chǎn)量一般比較低。另外一種新穎的DC細(xì)胞來(lái)源是，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞iPSC/胚胎干細(xì)胞ESC也可誘導(dǎo)成DC細(xì)胞：iPSC分化成CD34+的造血干細(xì)胞后，通過(guò)添加GM-CSF、IL4、TNF-α、OK432的培養(yǎng)體系，可以分化成樹(shù)突狀細(xì)胞(iDC)，iDC可以直接在iPSC上基因編輯導(dǎo)入特定抗原基因，從而大大縮短DC孵育抗原并遞呈給T細(xì)胞的時(shí)間^[4]。當(dāng)然，也可以直接購(gòu)買商品化的DC細(xì)胞，方便快捷，品質(zhì)有保障。

圖1 小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞發(fā)育圖譜^[2]

2、DC誘導(dǎo)分化與培養(yǎng)

由于DC細(xì)胞的樣本來(lái)源以及誘導(dǎo)方法也比較龐雜，在這里我們舉三個(gè)例子：

1)  人骨髓CD34+細(xì)胞誘導(dǎo)生成DC^[5]

①飼養(yǎng)層細(xì)胞OP9的培養(yǎng)和接種

a、OP9細(xì)胞在75cm²培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至密度為4×10³-1×10⁴細(xì)胞/cm²， OP9培養(yǎng)基（αMEM，20%FBS，青霉素-鏈霉素），37°C，5%CO₂；

b、收獲OP9細(xì)胞，將2-3mL胰蛋白酶-EDTA溶液加入培養(yǎng)瓶中，37℃消化5-15min，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞層，直到細(xì)胞變圓開(kāi)始脫落。加入6-8mL OP9完quan培養(yǎng)基，終止消化，輕輕吹打細(xì)胞；

c、將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，125×g離心10min，棄上清液，將OP9細(xì)胞沉淀重懸在新鮮預(yù)熱培養(yǎng)基中，細(xì)胞密度為2.5×10⁴個(gè)細(xì)胞/mL；

d、按照每孔200μL（5000個(gè)細(xì)胞）分裝到96孔U底組織培養(yǎng)處理板中，在37°C、5%CO₂中培養(yǎng)。

②DC分化

a、吸出預(yù)接種OP9細(xì)胞的培養(yǎng)基，并用200μL CD34+細(xì)胞懸浮液（3000個(gè)細(xì)胞）替換，繼續(xù)培養(yǎng)；

b、第6天，每個(gè)孔中取出100μL培養(yǎng)基，并用100μL預(yù)熱的DC分化培養(yǎng)基αMEM（abs9506）, 10%FBS（abs972）, 1%penicillin-streptomycin（abs9244）, 100ng/mL Flt3L（abs04375）, 20ng/mL SCF（abs04178）, 20mg/mL GM-CSF（abs00839）替換；在第12-21天收獲細(xì)胞，并且可在第12天和第18天半量換液。人骨髓CD34+細(xì)胞誘導(dǎo)生成更多DC細(xì)胞亞型，大家可以參考圖2。

圖2 人骨髓CD34+細(xì)胞誘導(dǎo)生成更多DC細(xì)胞亞型匯總^[5]

文中部分相關(guān)產(chǎn)品：

2)  單核細(xì)胞誘導(dǎo)生成MoDC^[6]

①用培養(yǎng)基RPMI 1640（含10%FBS）調(diào)整富集的單核細(xì)胞濃度至5×10⁶cells/mL，鋪于24孔板上，同時(shí)加入重組人IL-4 （abs04698）(500U/mL)和GM-CSF（abs00839）(500U/mL)，于37℃，5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

②48h后，半量換液，同時(shí)補(bǔ)充重組人IL-4(500U/mL)和GM-CSF(500U/mL)，繼續(xù)刺激2天；

③第5天，可收獲未成熟的樹(shù)突細(xì)胞，即單核細(xì)胞來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞(monocyte-Derived dendritic cells， MoDCs)，用于下游實(shí)驗(yàn)（如成熟DC的激活）；

④成熟DC激活：LPS(0.5μg/mL)（abs47014848）、pha(10ng/mL)（abs47014910）、IL-6(10ng/mL)（abs04044）、IL-1β(10ng/mL)（abs00802）、PGE2(1μmol/L)（abs819421）刺激24-48h。

文中部分相關(guān)產(chǎn)品：

3)  IPSC/ESC誘導(dǎo)DC細(xì)胞^[7]

①IPS細(xì)胞(或ES細(xì)胞)向造血祖細(xì)胞的分化

a、當(dāng)IPS或ES細(xì)胞達(dá)到70-80%密度時(shí)，使用Collagenase IV（abs47048003）在37°C、5%CO₂條件下消化40-60min，直至細(xì)胞團(tuán)邊緣卷起，終止消化；

b、細(xì)胞團(tuán)形成：將IPS或ES細(xì)胞團(tuán)通過(guò)細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，調(diào)整細(xì)胞團(tuán)大小，形成含有50-100個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)；

c、如果IPS或ES細(xì)胞團(tuán)要培養(yǎng)在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)上，接種前需去除MEF；在37°C、5%CO2和5%O₂條件下培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)基，以形成擬胚體EB；

d、從第1天開(kāi)始，根據(jù)分化天數(shù)準(zhǔn)備相應(yīng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(d1,d2,d4,d6)；

e、在分化的第6至14天（IPS細(xì)胞）或第21至28天（ES細(xì)胞）期間，觀察到造血祖細(xì)胞從EB中出現(xiàn)。

圖3 D2-D6 EB分化階段培養(yǎng)基

②IPS細(xì)胞（或ES細(xì)胞）衍生造血祖細(xì)胞分化為DC亞群

a、將輻射滅活過(guò)的OP9細(xì)胞以1.2x10⁴cells/cm₂密度接種在涂有0.1%明膠的培養(yǎng)皿上；收集造血祖細(xì)胞，并通過(guò)40μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾以去除剩余的EB；調(diào)整細(xì)胞密度1x10⁶-1.5x10⁶cells/mL于DC分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基中；

b、將細(xì)胞分為兩組，一組用于生成cDC1和cDC2（使用FSG4細(xì)胞因子組合），另一組用于生成cDC1和pDC（使用FSG細(xì)胞因子組合）；

在FSG4組中添加100ng/mL FLT3L（abs04375）、20ng/mL SCF（abs04178）、20ng/mL GM-CSF（abs00839）和20ng/mL IL-4（abs04698）；

在FSG組中添加100ng/mL FLT3L（abs04375）、20ng/mL SCF（abs04178）和10ng/mL GM-CSF（abs00839）；

c、將造血祖細(xì)胞懸液接種到OP9基質(zhì)細(xì)胞上，進(jìn)行共培養(yǎng)；每?jī)商爝M(jìn)行一次半量換液；在分化的第4天至第7天，將逐漸出現(xiàn)DC形態(tài)。

文中部分相關(guān)產(chǎn)品：

3、DC細(xì)胞亞型鑒定

DC細(xì)胞亞群可以分為漿DC、1型髓樣DC、2型髓樣DC等，DC細(xì)胞不同亞型、標(biāo)記物、細(xì)胞因子可以參考圖4。DC細(xì)胞亞型鑒定較常用的方法是流式，關(guān)于流式鑒定的基本內(nèi)容大家可以參考《免疫細(xì)胞培養(yǎng)攻略之分型鑒定（三）》。

圖4 小鼠和人DC亞群的表面標(biāo)記物、模式識(shí)別受體（PRR）、細(xì)胞因子^[8]

4、DC細(xì)胞熱門(mén)研究

DC細(xì)胞作為抗原呈遞能力max的免疫細(xì)胞，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要的作用，當(dāng)DC細(xì)胞功能受損時(shí)，腫瘤細(xì)胞很有可能利用這一方面產(chǎn)生免疫逃逸，并且，腫瘤微環(huán)境也會(huì)釋放很多抑制因子，進(jìn)而阻止DC祖細(xì)胞的正常分化，從而抑制T細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)^[9]。

圖5 DC細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境^[9]

DC細(xì)胞的熱門(mén)研究很多：腫瘤浸潤(rùn)DC細(xì)胞、髓系抑制細(xì)胞、DC疫苗、DC-CIK細(xì)胞療法、DC-T細(xì)胞療法等，在這里，小愛(ài)以流式分析小鼠結(jié)腸癌腫瘤浸潤(rùn)DC亞型為例（圖6）^[10]：CD11c+MHCII+雙陽(yáng)性髓系細(xì)胞→CD317+(pDC) → CD64+F4/80-(moDC) → CD103+CD11b?(cDC1)、 CD103-CD11b+(cDC2)。除了流式細(xì)胞術(shù)，想要研究腫瘤浸潤(rùn)DC細(xì)胞的利器還有很多：質(zhì)譜流式、單細(xì)胞測(cè)序等等（圖7）。

圖6 DC流式分析小鼠結(jié)腸癌腫瘤浸潤(rùn)DC亞型圈門(mén)邏輯^[10]

圖7 腫瘤浸潤(rùn)DC細(xì)胞研究思路匯總

參考文獻(xiàn)：

[1] Hart, D.N.J., Dendritic Cells: Unique Leukocyte Populations Which Control the Primary Immune Response. Blood, 1997. 90(9): p. 3245-3287.

[2] Anderson, D.A., et al., Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews Immunology, 2020. 21(2): p. 101-115.

[3] Balan, S., et al., Large-Scale Human Dendritic Cell Differentiation Revealing Notch-Dependent Lineage Bifurcation and Heterogeneity. Cell Reports, 2018. 24(7): p. 1902-1915.e6.

[4] Xue, D., et al., Induced pluripotent stem cell-derived engineered T cells, natural killer cells, macrophages, and dendritic cells in immunotherapy. Trends in Biotechnology, 2023. 41(7): p. 907-922.

[5] Lutz, M.B., et al., Guidelines for mouse and human DC generation. European Journal of Immunology, 2022. 53(11).

[6] Ulrich, H., et al., A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. Plos One, 2020. 15(4).

[7] Sontag, S., et al., Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPS Cells) and Embryonic Stem Cells (ES Cells) into Dendritic Cell (DC) Subsets. Bio-Protocol, 2017. 7(15).

[8] Macri, C., et al., Dendritic cell subsets. Seminars in Cell & Developmental Biology, 2018. 84: p. 11-21.

[9] Subtil, B., et al., The Therapeutic Potential of Tackling Tumor-Induced Dendritic Cell Dysfunction in Colorectal Cancer. Frontiers in Immunology, 2021. 12.

[10] Eich, C., et al., Isolation and high-dimensional flow cytometric analysis of tumor-infiltrating leukocytes in a mouse model of colorectal cancer. Frontiers in Immunology, 2024. 15.

今天講解就到這了，大家如有細(xì)胞培養(yǎng)問(wèn)題，歡迎一起交流哦！

本期小愛(ài)推薦

Absin產(chǎn)品線：

爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測(cè)、殘留檢測(cè)、多因子檢測(cè))；細(xì)胞培養(yǎng)(類器官試劑盒+基質(zhì)膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...

特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...