應用直接分化再生系統(tǒng)開展亞麻轉(zhuǎn)基因技術研究

一、引言

二、材料與方法

（一）植物材料

（二）培養(yǎng)基配制

1. 愈傷組織誘導培養(yǎng)基：以 MS 基本培養(yǎng)基為基礎，添加不同濃度的生長素（如 2,4 - D）和細胞分裂素（如 6 - BA），以及適量的蔗糖和瓊脂，調(diào)節(jié) pH 值至 5.8 左右。通過設置不同濃度梯度組合，篩選出適合亞麻愈傷組織誘導的培養(yǎng)基配方。

2. 直接分化培養(yǎng)基：在 MS 培養(yǎng)基中加入特定比例的植物生長調(diào)節(jié)劑，如低濃度的生長素與較高濃度的細胞分裂素，同時補充必要的有機營養(yǎng)成分和微量元素，以促進外植體直接分化出芽。

3. 生根培養(yǎng)基：采用 1/2 MS 培養(yǎng)基，添加適量的生長素（如 NAA），促進轉(zhuǎn)基因苗生根。

（三）外植體選擇與處理

（四）轉(zhuǎn)基因方法

1. 農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法

• 構(gòu)建含有目的基因（如抗蟲基因或品質(zhì)改良相關基因）的農(nóng)桿菌工程菌株。將活化后的農(nóng)桿菌接種到含有相應抗生素的液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

• 把預培養(yǎng)一定時間的亞麻外植體浸入農(nóng)桿菌菌液中，浸泡時間為 10 - 20 分鐘，然后用無菌濾紙吸干多余菌液，轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，共培養(yǎng) 2 - 3 天。共培養(yǎng)后，將外植體轉(zhuǎn)移至含有抗生素（用于篩選轉(zhuǎn)化細胞）的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導和篩選。

2. 基因槍法

• 制備包裹有目的基因的金粉或鎢粉微粒。將目的基因與微粒混合，加入適量的緩沖液和表面活性劑，充分混勻后進行微粒的包被處理。

• 利用基因槍將包被有目的基因的微粒高速射入亞麻外植體組織中。設置合適的基因槍參數(shù)，如壓力、射程等，以確保微粒能夠有效穿透外植體細胞壁并將基因?qū)爰毎麅?nèi)。射擊后的外植體在無菌條件下培養(yǎng)一段時間后，轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上進行后續(xù)篩選培養(yǎng)。

（五）轉(zhuǎn)基因植株的篩選與鑒定

1. 抗生素篩選：在愈傷組織誘導和分化培養(yǎng)過程中，利用培養(yǎng)基中添加的抗生素（如卡那霉素或潮霉素）對轉(zhuǎn)化細胞進行篩選。只有成功導入目的基因并表達相應抗生素抗性基因的細胞才能在篩選培養(yǎng)基上正常生長發(fā)育，形成愈傷組織并分化出芽和根。

2. 分子檢測

• PCR 檢測：提取轉(zhuǎn)基因植株的基因組 DNA，利用特異性引物對目的基因進行 PCR 擴增。通過檢測擴增產(chǎn)物的有無及大小，初步判斷目的基因是否整合到亞麻基因組中。

• Southern 雜交：對于 PCR 檢測陽性的植株，進一步進行 Southern 雜交分析。將基因組 DNA 進行限制性內(nèi)切酶消化，電泳分離后轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，與標記的目的基因探針進行雜交。通過雜交信號的強弱和位置，確定目的基因在基因組中的整合拷貝數(shù)和整合位點。

• RT - PCR 檢測：提取轉(zhuǎn)基因植株的總 RNA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，然后利用目的基因特異性引物進行 RT - PCR 擴增。通過檢測目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達情況，分析目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達活性。

（六）轉(zhuǎn)基因植株的表型分析

三、結(jié)果與分析

（一）直接分化再生體系的建立

1. 外植體對愈傷組織誘導和分化的影響
   不同外植體在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上的反應存在差異。子葉外植體在接種后 3 - 5 天開始出現(xiàn)輕微膨大，7 - 10 天逐漸形成淡黃色的愈傷組織，愈傷組織誘導率可達 60% - 70%；下胚軸外植體則在接種后 5 - 7 天開始有反應，誘導出的愈傷組織質(zhì)地相對較硬，誘導率約為 50% - 60%。在直接分化培養(yǎng)基上，子葉愈傷組織經(jīng)過 10 - 15 天培養(yǎng)開始分化出芽點，芽分化率約為 30% - 40%；下胚軸愈傷組織芽分化相對較晚，需要 15 - 20 天，芽分化率在 20% - 30%。

2. 培養(yǎng)基配方對再生的影響
   通過對不同濃度生長素和細胞分裂素組合的篩選，發(fā)現(xiàn)當愈傷組織誘導培養(yǎng)基中 2,4 - D 濃度為 1.0 - 2.0 mg/L，6 - BA 濃度為 0.5 - 1.0 mg/L 時，愈傷組織誘導效果較好；在直接分化培養(yǎng)基中，當 6 - BA 濃度為 2.0 - 3.0 mg/L，NAA 濃度為 0.1 - 0.2 mg/L 時，芽分化效率顯著提高，芽分化率可達到 40% - 50%。生根培養(yǎng)基中 NAA 濃度為 0.5 - 1.0 mg/L 時，轉(zhuǎn)基因苗生根狀況良好，生根率可達 80% 以上。

（二）轉(zhuǎn)基因方法的優(yōu)化與效果

1. 農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法
   經(jīng)過對農(nóng)桿菌菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間等因素的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當農(nóng)桿菌菌液 OD600 值為 0.5 - 0.8，侵染時間為 15 分鐘，共培養(yǎng)時間為 2 天時，轉(zhuǎn)化效率較高。通過抗生素篩選和分子檢測，獲得了一批轉(zhuǎn)基因植株。PCR 檢測結(jié)果顯示，約 30% - 40% 的抗性植株中檢測到目的基因的特異性擴增條帶；Southern 雜交結(jié)果表明，目的基因在轉(zhuǎn)基因植株基因組中的整合拷貝數(shù)為 1 - 3 個不等，整合位點較為隨機。

2. 基因槍法
   基因槍法轉(zhuǎn)化過程中，當金粉微粒直徑為 1.0 - 1.5 μm，基因槍壓力為 1100 - 1300 psi，射程為 6 - 9 cm 時，能夠獲得較好的轉(zhuǎn)化效果。經(jīng)篩選和檢測，基因槍法轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株獲得率相對較低，約為 10% - 20%，但目的基因整合較為穩(wěn)定，多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株中目的基因以單拷貝形式整合到基因組中。

（三）轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測與表型分析

1. 分子檢測結(jié)果
   對轉(zhuǎn)基因植株進行 RT - PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，部分轉(zhuǎn)基因植株中目的基因在轉(zhuǎn)錄水平有明顯表達，表達量與目的基因的功能特性和整合位點有關。在抗蟲基因轉(zhuǎn)基因植株中，表達量較高的植株在人工接蟲試驗中表現(xiàn)出較強的抗蟲性，葉片受損程度明顯低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辍?/p>

2. 表型分析結(jié)果
   在生長發(fā)育方面，部分轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甏嬖谝欢ú町?。一些轉(zhuǎn)基因植株的株高略有增加，莖粗變粗，葉片數(shù)量和葉面積也有所增大，可能與導入的生長調(diào)節(jié)相關基因有關。在品質(zhì)分析方面，如油脂含量改良基因轉(zhuǎn)基因植株，其種子中的油脂含量較非轉(zhuǎn)基因植株提高了 10% - 15%，同時脂肪酸組成也發(fā)生了一定變化，不飽和脂肪酸含量有所增加，這對于提高亞麻油的營養(yǎng)價值具有重要意義。

四、討論