培養(yǎng)基不能正常凝固的原因及解決辦法

  瓊脂具有特殊的溶點(diǎn)和凝固點(diǎn)，所含成分很難被微生物分解利用且不含抑制性成分，因此很適用于微生物培養(yǎng)基的制備，從而作為固體培養(yǎng)基最chang用的凝固劑，到目前為止，在這方面世界上還沒有一種能夠替代瓊脂的代用品。

  一些初期從事植物組織培養(yǎng)工作或微生物培養(yǎng)的人員，尤其是初學(xué)者，在配制培養(yǎng)基時(shí)往往會(huì)遇到培養(yǎng)基難以正常凝固的現(xiàn)象：或呈半流體、或wanquan呈液體狀態(tài)、同時(shí)還會(huì)現(xiàn)出各種顏色。本文將對(duì)瓊脂的凝固性以及影響其凝固性的關(guān)鍵因素作系統(tǒng)的介紹，并針對(duì)不同的操作方法進(jìn)行問答式評(píng)價(jià)，以期能幫助更多的人解決實(shí)際工作中的相關(guān)問題，少走彎路。

一、有關(guān)瓊脂的知識(shí)

  瓊脂，又名瓊膠或凍粉，因最初從日本海藻中提取，故又稱“洋菜”。瓊脂成品為白色或淡黃色粉末狀或細(xì)條形，主要是由復(fù)雜的大分子多糖類物質(zhì)組成。其水解物的組成有40%的D-半乳糖、3%硫酸酯和2%丙酮酸，實(shí)際上，它是瓊脂膠和瓊脂糖兩種成分的混合物。瓊脂膠是瓊脂糖的硫酸酯，瓊脂糖主要依靠氫鍵的引力形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。因此，瓊脂糖凝膠的穩(wěn)定性比那些以化學(xué)鍵交聯(lián)而形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝固劑的穩(wěn)定性要差一些。

  瓊脂溶于熱水而不溶于冷水，因此在配制培養(yǎng)基時(shí)需煮制瓊脂。隨著溫度的升高，瓊脂逐漸溶解，當(dāng)溫度下降到40℃時(shí)則開始凝固。配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意，由于各地生產(chǎn)的瓊脂的質(zhì)量不同，同樣濃度的瓊脂水溶液凝固后在硬度、透明度及色澤上會(huì)有所差異。劣質(zhì)瓊脂不僅凝固性差，而且?guī)в泻芏嚯s質(zhì)。

二、有關(guān)瓊脂凝固性的知識(shí)

  作為培養(yǎng)基的凝固劑，瓊脂的凝固性除與瓊脂本身的品質(zhì)有關(guān)外，還會(huì)受到滅菌溫度、滅菌時(shí)間、瓊脂量和pH值的影響。

  （1）0.7%～0.8%的瓊脂水溶液在冷卻后會(huì)很好凝固，對(duì)于常用的微生物培養(yǎng)基，瓊脂的用量基本趨于穩(wěn)定，通常條狀瓊脂的用量約為2%，粉狀瓊脂的用量為1%～1.5%。

  （2）培養(yǎng)基的酸堿度對(duì)瓊脂的凝固性影響很大，是瓊脂在正常濃度范圍內(nèi)能否凝固的關(guān)鍵因素，當(dāng)4.30<ph<10.05時(shí)，瓊脂水溶液均可正常凝固，超過此范圍，瓊脂的凝固性變差，培養(yǎng)基不能正常凝固。< span="">

  （3）在4.30<ph<10.05范圍內(nèi)，瓊脂的凝固性受高溫高壓(1.1 kg="" cm<="" span="">²，120℃)的影響很小，延長高溫高壓滅菌時(shí)間或反復(fù)高溫高壓處理均不會(huì)影響其凝固性。pH較高(5.0-8.0)時(shí)，瓊脂濃度是影響凝固等級(jí)的主要因素。

<ph<10.05范圍內(nèi)，瓊脂的凝固性受高溫高壓(1.1kg cm

  （4）當(dāng)配制的固體培養(yǎng)基pH低于3.44時(shí)，其凝固性會(huì)受到滅菌溫度、滅菌時(shí)間、瓊脂量和pH值的影響。其中滅菌溫度、滅菌時(shí)間與瓊脂凝固性呈負(fù)相關(guān)，瓊脂量、pH值與瓊脂凝固性呈正相關(guān)。但在這些因素中，瓊脂量的影響不是很大，因此在該類培養(yǎng)基的滅菌過程中應(yīng)該重點(diǎn)把握好滅菌溫度、滅菌時(shí)間和pH值。使用較低的滅菌溫度，較短的滅菌時(shí)間，適當(dāng)?shù)卦黾优囵B(yǎng)基的pH值就可以顯著提高瓊脂的凝固性。pH較低(≤4.0)時(shí)，pH是影響凝固等級(jí)的主要因素。

三、案例分析

  基于實(shí)驗(yàn)得出的理論知識(shí)，大家都比較好理解和接受，但在實(shí)際操作過程中，經(jīng)常會(huì)有人碰到瓊脂不能凝固的情況（如圖1），下面針對(duì)具體案例進(jìn)行分析討論：

圖1 滅菌后的培養(yǎng)基出現(xiàn)分層現(xiàn)象

案例一

  問：我使用的是**生產(chǎn)的瓊脂，用冷水就能溶解了，高壓蒸汽滅菌后就能使用了，最近在倒平板時(shí)，發(fā)現(xiàn)有幾塊怎么也不凝固，同一瓶子里的瓊脂只有幾塊不凝固，我專門放到第2天發(fā)現(xiàn)還是稀呼呼的。

  答：首先糾正一下，您說用冷水就能溶解了，這肯定不對(duì)：瓊脂溶于熱水而不溶于冷水，將瓊脂放在冷水中，充其量只能是把瓊脂浸濕了泡軟了，根本達(dá)不到溶解的程度，也就談不上均勻地分散在培養(yǎng)基溶液中了。既然分散不均勻，滅菌后倒出的平板，就容易產(chǎn)生瓊脂含量不一的結(jié)果，表現(xiàn)出來的現(xiàn)象就是您所描述的，同一瓶子里的瓊脂，有幾塊怎么也不凝固，即使放到第2天或更多天，也不會(huì)凝固，因?yàn)槔锩娴沫傊亢苌侔。_(dá)不到凝固的要求，即使放再多時(shí)間結(jié)果也是一樣。

  問：必須要wanquan煮化嗎？

  答：瓊脂必須煮沸，常溫下是溶解不了的，只有煮沸后再冷卻才會(huì)凝固。

  問：夏天溫度高的時(shí)候是不是就不用煮沸了？

  答：配好培養(yǎng)基后，一定要加熱攪拌溶解。培養(yǎng)基外包裝標(biāo)簽上說得很清楚，要加熱煮沸至wanquan溶解，夏天溫度再高也不會(huì)超過50度吧？所以天氣熱了也要這么做，使得培養(yǎng)基中各成分混合均勻。步驟不要省略！?。?/span>

  問：那我們以前都是同樣的操作，怎么都好著呢？

  答：正確的培養(yǎng)基配制方法應(yīng)該是先將含瓊脂培養(yǎng)基煮沸至wanquan溶解之后，再分裝入三角瓶中進(jìn)行滅菌，并且滅菌完畢從鍋里拿出來后，要及時(shí)搖一搖三角瓶（用力搖），使滅菌后的培養(yǎng)基中瓊脂能夠均勻分散在里面，然后再傾倒平皿。你之前沒出問題，不代表你的操作就是合乎要求的，你不按照正規(guī)的方法操作，遲早會(huì)出問題的，這不就被你碰到了嗎？

  另外，即使滅菌前沒有先煮沸再分裝滅菌，只在滅菌完畢，開鍋后第一時(shí)間將瓶內(nèi)培養(yǎng)基搖勻，也就不會(huì)出現(xiàn)你碰到的問題了。

  這里需要注意，搖勻，一定是用力搖勻，而不是隨手輕輕一晃就行了。

  問：為何還要搖??？你在煮沸、滅菌時(shí)，不就自然勻了嗎？

  答：滅菌時(shí)能自然勻了？這也是你自己認(rèn)為的吧？當(dāng)然很多人都會(huì)這么認(rèn)為。熬粥的時(shí)候滿鍋里都沸騰，稍放置一會(huì)兒，鍋底的粥是不是要稠一些？大同小異！

  問：可是滅菌后搖晃容易產(chǎn)生氣泡啊？

  答：開鍋拿出來后手搖幾下就勻了，少量氣泡稍微靜置就會(huì)消掉的，或者放到水浴鍋里恒溫到50度的時(shí)候一般就沒有氣泡了。臨倒平板前就不要搖了！那時(shí)候再搖，氣泡可能就不容易消掉了。

  問：那我怎么搖勻？我用500mL的三角瓶配500mL培養(yǎng)基，根本搖不起來！

  答：問題就出來這里，做微生物實(shí)驗(yàn)，將配好的培養(yǎng)基分裝到適當(dāng)容器中，培養(yǎng)基體積不應(yīng)超過容器容積的2/3(可參考GB 4789.28食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求)。也就是說不要將瓶子里裝得滿滿當(dāng)當(dāng)?shù)模@樣很容易導(dǎo)致瓊脂沉在下面，不容易搖勻。

  我們平時(shí)做實(shí)驗(yàn)，配500mL培養(yǎng)基用1000mL的瓶子，配200mL培養(yǎng)基用500mL瓶子，500mL的瓶子里最多裝400mL培養(yǎng)基的，你比較看看你的裝量。

  問：我們一直都這么配制的，只是最近的出了問題，同一瓶培養(yǎng)基，只有幾個(gè)板這樣的。

  答：培養(yǎng)基的標(biāo)簽上有明確的用法：稱23.5 g于1 L蒸餾水中，加熱煮沸wanquan溶解，121攝氏度滅菌15分鐘，冷卻至46攝氏度左右備用。

  對(duì)比上面的解答，看看你們一直以來的操作有哪些問題吧，然后按照正規(guī)的操作要求再堅(jiān)持一段時(shí)間，再出現(xiàn)同樣的問題再來找我好吧？(不搖勻的情況下，同一瓶培養(yǎng)基倒出的平板強(qiáng)度差異很大，可參考附錄表格)。

案例二

  問：配制的是營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，都是按照上面說的配制的，滅菌后放入冰箱怎么也不能wanquan凝固，在底部還有非常硬的像膠皮一樣的胨。請(qǐng)幫忙看看到底是怎么回事。

  答：有沒有想過最底部的非常硬的膠皮一樣的東西是什么？那就是相對(duì)很濃的瓊脂液冷卻形成的。如果把這一部分瓊脂趁熱搖勻，使其均勻分散在整瓶培養(yǎng)基里面呢？是不是上面就沒那么稀了，能凝固了，下面也沒那么稠了，硬度合適了。也就是說搖勻后倒平皿，整瓶培養(yǎng)基都能用了。

  你滅菌后沒經(jīng)過搖勻，瓊脂本來就沉積在瓶底，直接放入冰箱，瓶底迅速冷卻，大量的瓊脂就先凝固了，瓶子上面的部分含瓊脂就很少了，所以才會(huì)不凝固。不管放多久都不會(huì)改善??！

  問：聽說瓊脂太酸也不會(huì)凝固，是不是我們使用的培養(yǎng)基pH不合格??？

  答：pH合格不合格，你測一下不就知道了。在pH 5-10之間，pH對(duì)瓊脂的凝固性影響并沒有那么大。你用的都是常規(guī)培養(yǎng)基，pH怎么可能那么低嘛。另外，如果是pH值太低的話，加熱以后瓊脂會(huì)變性，底部就不會(huì)有凝固的瓊脂硬塊了，而會(huì)成一瓶糊糊。你這顯然是瓊脂混合不均勻引起的，使用前用微波溶化，晃一晃就好了。

  問：用兩個(gè)大燒杯把融化了的培養(yǎng)基來回傾倒混勻，然后倒皿，效果不錯(cuò)。

  答：道理是一樣的，就是為了使瓊脂混合均勻。但這種操作方法有點(diǎn)繁瑣，并且容易染菌，不提倡。

  問：像我這種情況，培養(yǎng)基還能用嗎？

  答：能用！重新水浴加熱，讓其wanquan溶解后，搖勻，傾倒平板即可?；蛘哂梦⒉訜?，要注意隨時(shí)觀察，經(jīng)常拿出來搖一搖，以免培養(yǎng)基噴出。

  問：培養(yǎng)基可以多次這樣反復(fù)融化使用嗎？

  答：不建議！如果不是不得已，建議現(xiàn)滅現(xiàn)用。

案例三

  問：今天分別用了伊紅美藍(lán)瓊脂和營養(yǎng)瓊脂兩種培養(yǎng)基做斜面，然而滅菌后做斜面都不凝固，這是為啥？有的凝固也就是一半凝。

  我的步驟：如營養(yǎng)瓊脂，按配比稱3.3g加100mL水，加熱攪拌溶解，分裝到試管中后加棉花塞，包扎后于121℃滅菌鍋中滅菌20分鐘，好了之后制作斜面，等了有半小時(shí)久，培養(yǎng)基都不凝固這是為何？

  答：你先要煮沸溶解培養(yǎng)基，攪拌均勻，稍冷后（50℃）盡快分裝，瓊脂的在水中需加熱至95℃時(shí)才開始熔化，你只是加熱攪拌溶解，瓊脂是不是真正溶解透了有待考證。

  試管滅菌完畢，拿出來晃一晃再擺斜面，否則容易上層稀不凝固，下層濃很容易凝固。跟三角瓶滅培養(yǎng)基是一樣的道理。

  問：我煮了還是沒很凝固這是為什么？

  答：先加熱煮沸，直至白色泡沫上升，然后再分裝、高溫高壓滅菌。

  問：白色泡沫上升好危險(xiǎn)，我試過被瓊脂沸騰連塞子噴我一臉！

  答：我們通常都是用搪瓷缸，最多裝液量1/3，煮沸三次，徹di煮透、溶透。

  問：溶解后用吸量管分裝，在吸量管中就凝固了，要怎么分裝？量筒嗎？

  答：我們都是用10 mL或5 mL移液槍分裝的，再把分裝試管塞好滅菌。

  煮沸溶解分裝然后滅菌制斜面成功了！再次提醒，滅菌后，溫度沒降下來前一定要搖一搖，不管瓶裝還是試管裝，都要搖勻?。?/strong>

案例四

  問：瓊脂培養(yǎng)基制作斜面為什么無法wanquan凝固，而做培養(yǎng)皿時(shí)wanquan凝固？

  答：瓊脂混合不均勻。相比三角瓶，試管的空間更加狹小，開鍋后一定要趁熱晃一晃，使底部沉積的瓊脂wanquan混勻。否則就容易導(dǎo)致試管底部凝固，而上部不凝固或凝固不好的問題。

案例五

  問：微生物檢驗(yàn)用的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，可以第二次高壓滅菌么?有何影響，如果加熱培養(yǎng)基使其溶化后，不一會(huì)兒就會(huì)凝，而如果用高壓滅菌就不會(huì)很快凝固，所以想再用高壓濕熱滅菌，加熱使其溶化，可否?

  答：二次高壓濕熱滅菌，會(huì)導(dǎo)致營養(yǎng)成分的損失。所以，最好是通過水浴加熱，溫度維持在100度，瓊脂就可wanquan化開，冷卻至50度左右，就可進(jìn)行倒板等操作了。

  問：培養(yǎng)基能加熱幾次?營養(yǎng)瓊脂和玫瑰紅鈉配置好了以后，我是保藏在冰箱里的，同一瓶最多能水浴幾次使用呢?

  答：在保證不染菌的情況下是可以多次使用的。瓊脂的溶解溫度是95度，若水浴的話時(shí)間來得及可以是沸水浴。若是時(shí)間緊迫可直接放在電爐上熔化，但要一直盯著，防止沸出來。如果是已經(jīng)滅好菌的玻璃器皿，可以用微波爐加熱，不過要注意觀察，防止沸騰出來。一般從冰箱里拿出來就用一次，不提倡反復(fù)融化。

  問：有人說加熱時(shí)間過長，也會(huì)導(dǎo)致瓊脂不凝固，是這樣嗎？

  答：是的。通常來說，滅完菌就要及時(shí)開鍋取出培養(yǎng)基。如果因?yàn)槠渌?，耽誤了，稍有延長也不大要緊，這里所說的加熱時(shí)間過長，是指高壓超過半小時(shí)或者滅菌后一直放在滅菌鍋內(nèi)很長時(shí)間甚至過夜的情況。這些都是錯(cuò)誤的操作，即使培養(yǎng)基能凝固，里面的營養(yǎng)成分也發(fā)生了很大的變化，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷造成很大影響。應(yīng)該杜絕類似的操作。

  通過上述幾個(gè)案例的分析，我們可以總結(jié)一下。遇到固體培養(yǎng)基不凝固的情況，通常首先考慮一下幾點(diǎn)：

  （1）瓊脂少，特別是自己配制培養(yǎng)基時(shí)，可能根本就漏加瓊脂了；

  （2）pH值不對(duì)，實(shí)驗(yàn)室用水PH過低，且配制完沒能調(diào)整pH，或者本身就是酸度很大的培養(yǎng)基；

  （3）反復(fù)加熱；

  （4）加熱時(shí)間過長；

  （5）滅菌前是否煮沸溶透，滅菌后是否搖勻。

  結(jié)合自己的實(shí)際操作，一項(xiàng)一項(xiàng)排除查找原因。這里面，zui簡單也最容易被忽視的就是滅菌后搖勻的問題。

  本實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，傾倒平皿前搖勻與不搖勻，所形成的平板強(qiáng)度差異很大，如果不經(jīng)搖勻直接傾倒，形成的平板有約有2/3凝膠強(qiáng)度過低，不能滿足試驗(yàn)要求，而最后倒出的幾塊平板強(qiáng)度會(huì)急劇升高，硬度過大，也影響使用；而搖勻后再傾注的平板，凝膠強(qiáng)度數(shù)值分布比較均勻，滿足試驗(yàn)要求（表1，圖2）。經(jīng)常聽到有人說，平常一直那么做（不煮沸，不搖勻），都沒問題，實(shí)際上那樣倒出來的平板只是都凝固了而已，即使能用，平板間凝膠強(qiáng)度的差異也是很大的。

  希望大家在實(shí)際操作中一定注意，嚴(yán)格按照說明書的要求進(jìn)行操作。

附圖表：

表1 用相同方法配制的等量培養(yǎng)基開鍋后搖勻與不搖勻傾倒成的平板強(qiáng)度

圖2 傾倒平板前培養(yǎng)基搖勻和不搖勻所傾注的平板強(qiáng)度規(guī)律

注:本文屬海博生物原創(chuàng),未經(jīng)允許不得轉(zhuǎn)載。