靶向聯(lián)合治療結(jié)腸直腸癌

結(jié)直腸癌（CRC）是全球靠前的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率高。最近，代謝重編程已成為癌癥的一個(gè)顯著特征，通過糖酵解的激活增加和乳酸生成的提高，維持其快速增殖和其他惡性特征。因此，破壞糖酵解被認(rèn)為是結(jié)直腸癌一種有前途的治療方法。3-溴丙酮酸（3BP）作為一種糖酵解抑制劑，能有效抑制一種負(fù)責(zé)ATP依賴性糖酵解啟動(dòng)的酶己糖激酶Ⅱ（HK2），然而在全身給藥時(shí)不穩(wěn)定。CD47是一種在CRC細(xì)胞的細(xì)胞膜上高度過表達(dá)“自我標(biāo)記”蛋白，可以通過SIRPα受體傳遞“別吃我”的信號(hào)來保護(hù)CRC細(xì)胞免受巨噬細(xì)胞吞噬作用。

四川大學(xué)華西醫(yī)院錢志勇團(tuán)隊(duì)，開發(fā)了一種納米顆粒MPB-3BP@CM NPs。該顆粒將3-溴丙酮酸（3BP）封裝在普魯士藍(lán)納米顆粒（MPB NPs）腔中，解決了游離的3BP在全身遞送時(shí)不穩(wěn)定的問題，并在其表面包裹有遺傳可編程的過表達(dá)MSIRPα（CM-MSIRPα）的細(xì)胞膜以同步識(shí)別和解決腫瘤，MSIRPα能在癌細(xì)胞上有效拮抗CD47，而不會(huì)在表達(dá)CD47的正常細(xì)胞中誘導(dǎo)毒性。

MPB-3BP@CM NPs對(duì)表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的抗腫瘤活性。首先，具有CM-MSIRPα隱身功能的MPB-3BP@CM NPs表現(xiàn)出長(zhǎng)血循環(huán)能力和高效的腫瘤部位靶向性，減輕了全身輸注誘導(dǎo)的不良反應(yīng)。其次，3BP通過抑制糖酵解破壞了能量供應(yīng)，導(dǎo)致饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，同時(shí)加劇巨噬細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的吞噬作用。第三，MPB-3BP@CM NPs在腫瘤組織中的積累可能允許使用光聲成像（PAI）進(jìn)行診斷，這為體內(nèi)光熱治療（Photothermal Therapy，PTT）提供了最佳時(shí)機(jī)，并確保了高效的腫瘤消融。最終，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)了MPB-3BP@CM NPs通過包括化學(xué)光熱免疫療法在內(nèi)的協(xié)同方法抑制和消融腫瘤的功效，同時(shí)表現(xiàn)出最小的全身毒性。因此，MPB-3BP@CM NPs的引入為提高CRC治療策略的有效性和安全性提供了新的視角。

細(xì)胞膜修飾納米顆粒具有源自其膜結(jié)構(gòu)和表面抗原的固有優(yōu)勢(shì)，包括延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間、特異性細(xì)胞識(shí)別以及免疫療法的潛力。在此，作者介紹了一種名為MPB-3BP@CM NPs的細(xì)胞膜仿生納米藥物平臺(tái)，這種納米顆粒由微孔普魯士藍(lán)納米顆粒（MPB NPs）組成，這些納米顆粒隱藏在遺傳可編程的細(xì)胞膜中，作為3-溴丙酮酸（3BP）的載體，顯示出信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α（SIRPα）的變體，并增強(qiáng)對(duì)蛋白CD47的親和力。MPB-3BP@CM NPs繼承了原始細(xì)胞膜的特性，可以延長(zhǎng)在血液中循環(huán)時(shí)間，并有效地靶向結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）細(xì)胞膜上的CD47，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)CRC細(xì)胞的吞噬作用。己糖激酶II（HK2）抑制劑3BP可以抑制糖酵解，導(dǎo)致三磷酸腺苷（ATP）水平和乳酸生成降低，它還能促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）向抗腫瘤M1表型的極化。此外，與MPB NPs介導(dǎo)的光熱療法（PTT）相結(jié)合，可提高對(duì)腫瘤的治療效果。這些優(yōu)勢(shì)使MPB-3BP@CM NPs成為未來開發(fā)CRC創(chuàng)新治療方法的一個(gè)有吸引力的載體。同時(shí)引入了一種用于設(shè)計(jì)用于腫瘤治療的疾病定制細(xì)胞膜的工程方法。

1.MPB-3BP@CM NPs的制備和表征

作者將3BP封裝到具有多孔特性和均勻立方結(jié)構(gòu)MPB NPs腔中（圖2a-1），得到MPB-3BP NPs（圖2a-2），制備在細(xì)胞膜上穩(wěn)定表達(dá)人MSIRPα受體的HEK 293T細(xì)胞（圖2b），將CM-MSIRPα和MPB-3BP NPs兩種組分通過400nm和200nm聚碳酸酯多孔膜共擠出以獲得MPB-3BP@CM NPs，最終得到具有核殼結(jié)構(gòu)的球形MPB-3BP@CM NP（圖2c、d），Western blot測(cè)定顯示人MSIRPα受體在HEK 293T細(xì)胞裂解物、HEK 293T-MSIRPα細(xì)胞裂解物、CM-MSIRPα和MPB-3BP@CM NPs上表達(dá)（圖2e），并用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測(cè)量了在不同條件下孵育的MPB-3BP@CM NPs的大小，MPB-3BP@CM NPs其在生理環(huán)境中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性（圖2g、h）。

體外釋放動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明MPB-3BP@CM NPs具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性（圖2i、j）和光熱性能（圖2l、m），且激光照射可以觸發(fā)藥物釋放（圖2k），使MPB-3BP@CM NPs成為一種有前途的PTT癌癥治療納米劑。

2.細(xì)胞結(jié)合和細(xì)胞攝取

HCT116細(xì)胞在攝取MPB 3BP@CM NP方面表現(xiàn)出顯著的效率（圖3a），并在HCT116細(xì)胞裂解物中檢測(cè)到CD47受體的表達(dá)（圖3b），MPB-3BP@CM NPs在2小時(shí)孵育期后與HCT116細(xì)胞的細(xì)胞膜表面的強(qiáng)烈結(jié)合，當(dāng)HCT116細(xì)胞與CD47一抗預(yù)孵育時(shí)，MPB-3BP@CM NPs的結(jié)合顯著降低。MPB-3BP@CM NPs（在其表面呈遞MSIRPα受體）與HCT116細(xì)胞之間通過MSIRPα和CD47之間的結(jié)合進(jìn)行有效相互作用。

3.體外細(xì)胞毒性和抗腫瘤效率

溶血試驗(yàn)（圖3c）的結(jié)果顯示，MPB-3BP@CM NPs具有優(yōu)異的血液相容性，細(xì)胞毒作用也可以忽略不計(jì)。通過體外細(xì)胞攝取的結(jié)果（圖3d）選取Cy7.5作為3BP的替代物。采用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡( CLSM )對(duì)MPB - Cy7.5 @ CM NPs處理的HCT116細(xì)胞進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，隨著共孵育時(shí)間從1?h延長(zhǎng)至6?h，HCT116細(xì)胞的熒光強(qiáng)度增加了約3倍（圖3e）。

作者使用MTT測(cè)定法評(píng)估MPB-3BP@CM NPs的體外抗腫瘤效率（圖g），結(jié)果顯示，MPB-3BP@CM NPs聯(lián)合激光照射表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗癌活性，其較強(qiáng)的抗癌療效可歸因于MPB-3BP@CM NPs的細(xì)胞攝取增強(qiáng)，以及MPB-3BP@CM NPs的化療/PTT聯(lián)合治療。在該納米系統(tǒng)中，3BP介導(dǎo)的糖酵解抑制在體外誘導(dǎo)對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性中起重要作用。

4.調(diào)節(jié)細(xì)胞糖酵解途徑

作者評(píng)估了用MPB-3BP@CM NPs（200 μg/mL）處理8h和14h的HCT116細(xì)胞凋亡（圖3j、k），并對(duì)葡萄糖代謝物分析（圖3l）和轉(zhuǎn)錄譜分析（圖3m）。結(jié)果表明MPB-3BP@CM NPs具有在體內(nèi)破壞腫瘤細(xì)胞葡萄糖代謝途徑的能力，導(dǎo)致ATP和乳酸等各種代謝物質(zhì)減少。結(jié)果表明MPB-3BP@CM NPs具有調(diào)節(jié)腫瘤糖酵解代謝的能力，并能有效減弱HCT116細(xì)胞中ATP和乳酸的產(chǎn)生。

5.誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)

腫瘤微環(huán)境（TME）中乳酸水平升高與促進(jìn)血管生成、轉(zhuǎn)移和免疫抑制有關(guān)。

作者使用流式細(xì)胞術(shù)證明MPB-3BP@CM NPs可以在體外和體內(nèi)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化和巨噬細(xì)胞吞噬作用（圖4a、b），并用ELISA測(cè)定不同體外治療組細(xì)胞因子IL-6（圖4c）、IL-12（圖4d）、IL-10（圖4e）和TGF-β（圖4f）的分泌水平，定量分析顯示，MPB-3BP@CM NPs介導(dǎo)的CD47阻斷在體外增強(qiáng)了BMDMs對(duì)HCT116-EGPF癌細(xì)胞的吞噬作用（圖4g-k）。

不同處理后小鼠腫瘤組織中IL-6（圖4l）、IL-12（圖4m）、IL-10（圖4n）和TGF-β（圖4o）分泌水平，免疫熒光檢測(cè)（圖4p），MPB-3BP@CM NPs+激光處理后TAMs向M1表型的極化有所改善（圖4q），表明激光處理有效實(shí)現(xiàn)了特異性抗腫瘤免疫的增強(qiáng)。體外和體內(nèi)研究都明確表明MPB-3BP@CM NP可引發(fā)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

6.MPB-3BP@CM NPs的藥代動(dòng)力學(xué)、組織分布和腫瘤積累

作者使用HCT116荷瘤雄性BALB/c裸鼠模型研究了MPB-3BP@CM NPs的藥代動(dòng)力學(xué)（圖5a），在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)通過熒光成像檢查納米顆粒在HCT116荷瘤雄性BALB/c裸鼠中的體內(nèi)分布（圖5b），納米顆粒在腫瘤和主要器官中分布的IVIS光譜圖像（圖5c）；使用ICP定量腫瘤中納米顆粒積累（圖5d），體內(nèi)蓄積結(jié)果顯示，MPB-3BP@CM NPs具有良好的腫瘤靶向性，在6?h達(dá)到最大蓄積量（圖5e、f），表明CM-MSIRPα包被的MPB-3BP@CM NPs具有顯著的長(zhǎng)循環(huán)能力，足以到達(dá)靶組織，能夠?qū)崿F(xiàn)預(yù)期的腫瘤靶向性和蓄積性；在功率密度為1.0?W/cm²的808?nm激光照射下，HCT116荷瘤雄性BALB/c裸鼠隨時(shí)間變化的紅外熱像圖（圖5g），并記錄了照射期間腫瘤部位表面的溫度曲線（圖5h），在激光照射5?min后，MPB-3BP@CM NPs?+?激光組的腫瘤溫度升至53.7?℃，證實(shí)了MPB-3BP@CMNPs在體內(nèi)表現(xiàn)出高的光熱轉(zhuǎn)換效率，在腫瘤靶向和藥物遞送方面具有的優(yōu)勢(shì)。

結(jié)果表明MPB-3BP@CM NP增強(qiáng)的血液循環(huán)能力可能源于它們的“隱蔽”性質(zhì)，這得益于富含膜蛋白和抗原的天然細(xì)胞膜，從而逃避了宿主免疫系統(tǒng)的檢測(cè)。最終，MPB 3BP@CM NP的延長(zhǎng)流通有望充分促進(jìn)它們遞送到靶點(diǎn)。

7.體內(nèi)抗腫瘤

MPB-3BP@CM NPs在破壞腫瘤糖代謝、刺激腫瘤免疫以及表現(xiàn)出較強(qiáng)的腫瘤靶向能力，作者進(jìn)一步研究了MPB-3BP@CM NPs抗CRC的功效。

首先，利用HCT116腫瘤模型研究MPB-3BP@CM NPs在體內(nèi)的抗癌性能，對(duì)小鼠進(jìn)行監(jiān)測(cè)，直到腫瘤體積達(dá)到~100mm3，然后隨機(jī)分為12組，給予不同的治療方案(圖5a)。記錄各組的個(gè)體（圖6b）、平均腫瘤生長(zhǎng)曲線（圖6c）、不同治療組的腫瘤重量（圖6d）、每組中小鼠的體重（圖6e）、肝臟（圖6f）和腎臟（圖6g）功能生物標(biāo)志物的血清水平，及不同治療組的生存曲線（圖6h）。每組選取有代表性的腫瘤進(jìn)行H&E染色（圖6i）。

在體外，MPB-3BP@CM NPs聯(lián)合激光照射可有效抑制HT29細(xì)胞，因此，使用人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29腫瘤模型進(jìn)行進(jìn)一步研究MPB-3BP@CM NPs的體內(nèi)抗癌療效。記錄各組的個(gè)體（圖6j）和平均腫瘤生長(zhǎng)曲線不同治療組的腫瘤重量（圖6k）。每組中小鼠的體重（圖6m）不同治療組的生存曲線（圖6n），將每組腫瘤的代表性H&E染色（圖6o）。MPB-3BP@CM NPs聯(lián)合激光照射在體內(nèi)顯示出對(duì)HT29腫瘤生長(zhǎng)的有效抑制作用，顯著延長(zhǎng)了小鼠的生存期

結(jié)果表明CM-MSIRPα賦予3BP@CM NPs、MPB@CM NPs和MPB-3BP@CM NPs在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間保持血液循環(huán)穩(wěn)定的能力，且無體重或組織病理學(xué)異常，證實(shí)了MPB-3BP@CM NPs給藥治療的安全性和生物相容性。

本論文研究了MPB-3BP@CM納米粒子（NPs）用于結(jié)直腸癌（CRC）靶向治療的開發(fā)和療效。這些納米顆粒具有核殼結(jié)構(gòu)，將微孔普魯士藍(lán)納米顆粒（MPB NPs）與糖酵解抑制劑3-溴丙酮酸（3BP）相結(jié)合，并將其包裹在細(xì)胞膜中，以增強(qiáng)靶向性和免疫調(diào)節(jié)作用。研究表明，這些納米粒改善了藥物遞送，延長(zhǎng)了循環(huán)時(shí)間，增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的吞噬作用。為提高療效，它們還集成了光熱治療（PTT），在體外和體內(nèi)模型中都顯示出顯著的抗癌效果。該納米粒促進(jìn)巨噬細(xì)胞向抗腫瘤M1表型極化，增強(qiáng)免疫反應(yīng)，抑制腫瘤生長(zhǎng)，且無全身毒性。該研究強(qiáng)調(diào)了MPB-3BP@CM NPs作為CRC治療的一種有前途的多模式治療方法的潛力，有助于癌癥代謝的理解和個(gè)性化醫(yī)療的發(fā)展。