靶向聯(lián)合治療結(jié)腸直腸癌

結(jié)直腸癌（CRC）是全球靠前的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率高。最近，代謝重編程已成為癌癥的一個顯著特征，通過糖酵解的激活增加和乳酸生成的提高，維持其快速增殖和其他惡性特征。因此，破壞糖酵解被認為是結(jié)直腸癌一種有前途的治療方法。3-溴丙酮酸（3BP）作為一種糖酵解抑制劑，能有效抑制一種負責ATP依賴性糖酵解啟動的酶己糖激酶Ⅱ（HK2），然而在全身給藥時不穩(wěn)定。CD47是一種在CRC細胞的細胞膜上高度過表達“自我標記”蛋白，可以通過SIRPα受體傳遞“別吃我”的信號來保護CRC細胞免受巨噬細胞吞噬作用。

四川大學華西醫(yī)院錢志勇團隊，開發(fā)了一種納米顆粒MPB-3BP@CM NPs。該顆粒將3-溴丙酮酸（3BP）封裝在普魯士藍納米顆粒（MPB NPs）腔中，解決了游離的3BP在全身遞送時不穩(wěn)定的問題，并在其表面包裹有遺傳可編程的過表達MSIRPα（CM-MSIRPα）的細胞膜以同步識別和解決腫瘤，MSIRPα能在癌細胞上有效拮抗CD47，而不會在表達CD47的正常細胞中誘導毒性。

MPB-3BP@CM NPs對表現(xiàn)出顯著增強的抗腫瘤活性。首先，具有CM-MSIRPα隱身功能的MPB-3BP@CM NPs表現(xiàn)出長血循環(huán)能力和高效的腫瘤部位靶向性，減輕了全身輸注誘導的不良反應。其次，3BP通過抑制糖酵解破壞了能量供應，導致饑餓誘導的細胞凋亡，同時加劇巨噬細胞對癌細胞的吞噬作用。第三，MPB-3BP@CM NPs在腫瘤組織中的積累可能允許使用光聲成像（PAI）進行診斷，這為體內(nèi)光熱治療（Photothermal Therapy，PTT）提供了最佳時機，并確保了高效的腫瘤消融。最終，體外和體內(nèi)實驗的結(jié)果證實了MPB-3BP@CM NPs通過包括化學光熱免疫療法在內(nèi)的協(xié)同方法抑制和消融腫瘤的功效，同時表現(xiàn)出最小的全身毒性。因此，MPB-3BP@CM NPs的引入為提高CRC治療策略的有效性和安全性提供了新的視角。

細胞膜修飾納米顆粒具有源自其膜結(jié)構(gòu)和表面抗原的固有優(yōu)勢，包括延長血液循環(huán)時間、特異性細胞識別以及免疫療法的潛力。在此，作者介紹了一種名為MPB-3BP@CM NPs的細胞膜仿生納米藥物平臺，這種納米顆粒由微孔普魯士藍納米顆粒（MPB NPs）組成，這些納米顆粒隱藏在遺傳可編程的細胞膜中，作為3-溴丙酮酸（3BP）的載體，顯示出信號調(diào)節(jié)蛋白α（SIRPα）的變體，并增強對蛋白CD47的親和力。MPB-3BP@CM NPs繼承了原始細胞膜的特性，可以延長在血液中循環(huán)時間，并有效地靶向結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）細胞膜上的CD47，增強巨噬細胞對CRC細胞的吞噬作用。己糖激酶II（HK2）抑制劑3BP可以抑制糖酵解，導致三磷酸腺苷（ATP）水平和乳酸生成降低，它還能促進腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）向抗腫瘤M1表型的極化。此外，與MPB NPs介導的光熱療法（PTT）相結(jié)合，可提高對腫瘤的治療效果。這些優(yōu)勢使MPB-3BP@CM NPs成為未來開發(fā)CRC創(chuàng)新治療方法的一個有吸引力的載體。同時引入了一種用于設計用于腫瘤治療的疾病定制細胞膜的工程方法。

1.MPB-3BP@CM NPs的制備和表征

作者將3BP封裝到具有多孔特性和均勻立方結(jié)構(gòu)MPB NPs腔中（圖2a-1），得到MPB-3BP NPs（圖2a-2），制備在細胞膜上穩(wěn)定表達人MSIRPα受體的HEK 293T細胞（圖2b），將CM-MSIRPα和MPB-3BP NPs兩種組分通過400nm和200nm聚碳酸酯多孔膜共擠出以獲得MPB-3BP@CM NPs，最終得到具有核殼結(jié)構(gòu)的球形MPB-3BP@CM NP（圖2c、d），Western blot測定顯示人MSIRPα受體在HEK 293T細胞裂解物、HEK 293T-MSIRPα細胞裂解物、CM-MSIRPα和MPB-3BP@CM NPs上表達（圖2e），并用動態(tài)光散射（DLS）測量了在不同條件下孵育的MPB-3BP@CM NPs的大小，MPB-3BP@CM NPs其在生理環(huán)境中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性（圖2g、h）。

體外釋放動力學結(jié)果表明MPB-3BP@CM NPs具有較強的穩(wěn)定性（圖2i、j）和光熱性能（圖2l、m），且激光照射可以觸發(fā)藥物釋放（圖2k），使MPB-3BP@CM NPs成為一種有前途的PTT癌癥治療納米劑。

2.細胞結(jié)合和細胞攝取

HCT116細胞在攝取MPB 3BP@CM NP方面表現(xiàn)出顯著的效率（圖3a），并在HCT116細胞裂解物中檢測到CD47受體的表達（圖3b），MPB-3BP@CM NPs在2小時孵育期后與HCT116細胞的細胞膜表面的強烈結(jié)合，當HCT116細胞與CD47一抗預孵育時，MPB-3BP@CM NPs的結(jié)合顯著降低。MPB-3BP@CM NPs（在其表面呈遞MSIRPα受體）與HCT116細胞之間通過MSIRPα和CD47之間的結(jié)合進行有效相互作用。

3.體外細胞毒性和抗腫瘤效率

溶血試驗（圖3c）的結(jié)果顯示，MPB-3BP@CM NPs具有優(yōu)異的血液相容性，細胞毒作用也可以忽略不計。通過體外細胞攝取的結(jié)果（圖3d）選取Cy7.5作為3BP的替代物。采用流式細胞術和激光共聚焦顯微鏡( CLSM )對MPB - Cy7.5 @ CM NPs處理的HCT116細胞進行分析，結(jié)果顯示，隨著共孵育時間從1?h延長至6?h，HCT116細胞的熒光強度增加了約3倍（圖3e）。

作者使用MTT測定法評估MPB-3BP@CM NPs的體外抗腫瘤效率（圖g），結(jié)果顯示，MPB-3BP@CM NPs聯(lián)合激光照射表現(xiàn)出強大的抗癌活性，其較強的抗癌療效可歸因于MPB-3BP@CM NPs的細胞攝取增強，以及MPB-3BP@CM NPs的化療/PTT聯(lián)合治療。在該納米系統(tǒng)中，3BP介導的糖酵解抑制在體外誘導對腫瘤細胞的細胞毒性中起重要作用。

4.調(diào)節(jié)細胞糖酵解途徑

作者評估了用MPB-3BP@CM NPs（200 μg/mL）處理8h和14h的HCT116細胞凋亡（圖3j、k），并對葡萄糖代謝物分析（圖3l）和轉(zhuǎn)錄譜分析（圖3m）。結(jié)果表明MPB-3BP@CM NPs具有在體內(nèi)破壞腫瘤細胞葡萄糖代謝途徑的能力，導致ATP和乳酸等各種代謝物質(zhì)減少。結(jié)果表明MPB-3BP@CM NPs具有調(diào)節(jié)腫瘤糖酵解代謝的能力，并能有效減弱HCT116細胞中ATP和乳酸的產(chǎn)生。

5.誘導有效的免疫反應

腫瘤微環(huán)境（TME）中乳酸水平升高與促進血管生成、轉(zhuǎn)移和免疫抑制有關。

作者使用流式細胞術證明MPB-3BP@CM NPs可以在體外和體內(nèi)，誘導巨噬細胞極化和巨噬細胞吞噬作用（圖4a、b），并用ELISA測定不同體外治療組細胞因子IL-6（圖4c）、IL-12（圖4d）、IL-10（圖4e）和TGF-β（圖4f）的分泌水平，定量分析顯示，MPB-3BP@CM NPs介導的CD47阻斷在體外增強了BMDMs對HCT116-EGPF癌細胞的吞噬作用（圖4g-k）。

不同處理后小鼠腫瘤組織中IL-6（圖4l）、IL-12（圖4m）、IL-10（圖4n）和TGF-β（圖4o）分泌水平，免疫熒光檢測（圖4p），MPB-3BP@CM NPs+激光處理后TAMs向M1表型的極化有所改善（圖4q），表明激光處理有效實現(xiàn)了特異性抗腫瘤免疫的增強。體外和體內(nèi)研究都明確表明MPB-3BP@CM NP可引發(fā)有效的抗腫瘤免疫反應。

6.MPB-3BP@CM NPs的藥代動力學、組織分布和腫瘤積累

作者使用HCT116荷瘤雄性BALB/c裸鼠模型研究了MPB-3BP@CM NPs的藥代動力學（圖5a），在預定時間點通過熒光成像檢查納米顆粒在HCT116荷瘤雄性BALB/c裸鼠中的體內(nèi)分布（圖5b），納米顆粒在腫瘤和主要器官中分布的IVIS光譜圖像（圖5c）；使用ICP定量腫瘤中納米顆粒積累（圖5d），體內(nèi)蓄積結(jié)果顯示，MPB-3BP@CM NPs具有良好的腫瘤靶向性，在6?h達到最大蓄積量（圖5e、f），表明CM-MSIRPα包被的MPB-3BP@CM NPs具有顯著的長循環(huán)能力，足以到達靶組織，能夠?qū)崿F(xiàn)預期的腫瘤靶向性和蓄積性；在功率密度為1.0?W/cm²的808?nm激光照射下，HCT116荷瘤雄性BALB/c裸鼠隨時間變化的紅外熱像圖（圖5g），并記錄了照射期間腫瘤部位表面的溫度曲線（圖5h），在激光照射5?min后，MPB-3BP@CM NPs?+?激光組的腫瘤溫度升至53.7?℃，證實了MPB-3BP@CMNPs在體內(nèi)表現(xiàn)出高的光熱轉(zhuǎn)換效率，在腫瘤靶向和藥物遞送方面具有的優(yōu)勢。

結(jié)果表明MPB-3BP@CM NP增強的血液循環(huán)能力可能源于它們的“隱蔽”性質(zhì)，這得益于富含膜蛋白和抗原的天然細胞膜，從而逃避了宿主免疫系統(tǒng)的檢測。最終，MPB 3BP@CM NP的延長流通有望充分促進它們遞送到靶點。

7.體內(nèi)抗腫瘤

MPB-3BP@CM NPs在破壞腫瘤糖代謝、刺激腫瘤免疫以及表現(xiàn)出較強的腫瘤靶向能力，作者進一步研究了MPB-3BP@CM NPs抗CRC的功效。

首先，利用HCT116腫瘤模型研究MPB-3BP@CM NPs在體內(nèi)的抗癌性能，對小鼠進行監(jiān)測，直到腫瘤體積達到~100mm3，然后隨機分為12組，給予不同的治療方案(圖5a)。記錄各組的個體（圖6b）、平均腫瘤生長曲線（圖6c）、不同治療組的腫瘤重量（圖6d）、每組中小鼠的體重（圖6e）、肝臟（圖6f）和腎臟（圖6g）功能生物標志物的血清水平，及不同治療組的生存曲線（圖6h）。每組選取有代表性的腫瘤進行H&E染色（圖6i）。

在體外，MPB-3BP@CM NPs聯(lián)合激光照射可有效抑制HT29細胞，因此，使用人結(jié)腸癌細胞系HT29腫瘤模型進行進一步研究MPB-3BP@CM NPs的體內(nèi)抗癌療效。記錄各組的個體（圖6j）和平均腫瘤生長曲線不同治療組的腫瘤重量（圖6k）。每組中小鼠的體重（圖6m）不同治療組的生存曲線（圖6n），將每組腫瘤的代表性H&E染色（圖6o）。MPB-3BP@CM NPs聯(lián)合激光照射在體內(nèi)顯示出對HT29腫瘤生長的有效抑制作用，顯著延長了小鼠的生存期

結(jié)果表明CM-MSIRPα賦予3BP@CM NPs、MPB@CM NPs和MPB-3BP@CM NPs在體內(nèi)長時間保持血液循環(huán)穩(wěn)定的能力，且無體重或組織病理學異常，證實了MPB-3BP@CM NPs給藥治療的安全性和生物相容性。

本論文研究了MPB-3BP@CM納米粒子（NPs）用于結(jié)直腸癌（CRC）靶向治療的開發(fā)和療效。這些納米顆粒具有核殼結(jié)構(gòu)，將微孔普魯士藍納米顆粒（MPB NPs）與糖酵解抑制劑3-溴丙酮酸（3BP）相結(jié)合，并將其包裹在細胞膜中，以增強靶向性和免疫調(diào)節(jié)作用。研究表明，這些納米粒改善了藥物遞送，延長了循環(huán)時間，增強了巨噬細胞對癌細胞的吞噬作用。為提高療效，它們還集成了光熱治療（PTT），在體外和體內(nèi)模型中都顯示出顯著的抗癌效果。該納米粒促進巨噬細胞向抗腫瘤M1表型極化，增強免疫反應，抑制腫瘤生長，且無全身毒性。該研究強調(diào)了MPB-3BP@CM NPs作為CRC治療的一種有前途的多模式治療方法的潛力，有助于癌癥代謝的理解和個性化醫(yī)療的發(fā)展。