洋蔥中非揮發(fā)性農藥殘留的定性與定量篩查

摘要本應用簡報采用一種基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜平臺的數(shù)據(jù)非依賴型采集方法，結合固相萃取凈化和農藥高分辨精確質量數(shù)據(jù)庫與譜圖庫查詢的多農殘分析策略，開展 2020 年度歐盟農藥殘留檢測能力驗證項目中關于洋蔥基質中無清單農藥的定性篩查和基于清單農藥的定量篩查（EUPT-SM12 和 EUPT-FV22）?；跉W盟定量篩查清單中適合電噴霧離子化的 173 種農藥，在洋蔥基質中對該分析方法進行驗證。結果表明，該方法對其中 165 種農藥的篩查限、定量限、線性、加標回收率和精密度均較為滿意，滿足對這些農藥定性篩查和準確定量測定的方法合格性要求。應用所述方法對 SM12 和FV22 樣品進行測試。結果發(fā)現(xiàn)，所篩查出的農藥化合物與組織方添加的農藥一致，無假陽性和假陰性，并且對于要求定量篩查的 FV22 樣品的定量結果準確，表明該方法能夠滿足歐盟關于農藥非靶向定性篩查和基于清單化合物的定量篩查的要求。

前言目前有超過 1000 種農藥用于防治農作物的病蟲草害，不當使用會導致農藥殘留于各類農產品中，可能對消費者的健康構成潛在威脅。因此，食用農產品中的農藥殘留一直是全球監(jiān)管機構監(jiān)測的重點。為確保監(jiān)測結果的可靠性，依據(jù)歐盟法規(guī) 396/2005/EC，所有在歐盟法規(guī)控制框架下的農殘檢測實驗室每年均需要參加由歐盟健康與消費者保護委員會 (DG-SANCO) 組織的農殘能力測試。歐盟參比實驗室 (EURL) 根據(jù)歐盟法規(guī) Reg. 882/2004/EC代表 DG-SANCO 組織年度關于農殘檢測的能力驗證項目（簡稱EUPT）。該驗證項目有助于了解相關檢測實驗室的檢測數(shù)據(jù)質量、準確度以及各實驗室間的可比性。歐盟域外實驗室經 DGSANCO 許可后可以參加該能力驗證項目。目前，色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜法仍是農殘檢測的方法。但使用該方法時，需要針對每種化合物預先編輯其待采集的特征離子對；再者，由于分辨率較低，使得利用三重四極桿質譜進行檢測時可能出現(xiàn)假陽性；另外，能夠檢測的農藥數(shù)量也受到儀器掃描速率的限制，且無法對采集清單之外的農藥進行檢測。因此，為了提高復雜基質中農藥殘留的檢測能力，并實現(xiàn)對采集清單外的農藥進行回溯性篩查，我們在過去十余年中一直致力于采用色譜-高分辨質譜聯(lián)用手段來開展農產品中的農藥殘留篩查。相繼開發(fā)出用于蘋果、番茄、紫甘藍、芒果、香蕉、棉籽殼等各類農產品基質中農藥殘留的高通量定性篩查與準確定量方法[1-4]。

本應用簡報介紹了 2020 年度參與 EUPT 關于洋蔥基質中的農藥篩查與測定的結果?；?2020 年度歐盟定量篩查清單中適合電噴霧離子化的 173 種農藥，在洋蔥基質中對實驗室開發(fā)的多農殘同時定性篩查與準確定量的策略與方法[2] 進行篩查限、定量限、線性、加標回收率和精密度等方法性能評價；然后利用該方法對EUPT-SM12 和 EUPT-FV22 樣品進行篩查。所篩查出的農藥種類和定量結果與歐盟組織方公布的添加農藥種類及含量一致，表明所開發(fā)的多農殘篩查與定量方法準確可靠，能夠滿足歐盟對農藥殘留的非靶向篩查和準確定量監(jiān)測的要求。

實驗部分試劑和樣品所有 173 種農藥標準品均購自天津阿爾塔科技有限公司，純度≥ 98%；甲酸和醋酸銨均為 LC/MS 級，購自美國 Merck 公司；乙腈和甲苯均為色譜純，購自美國 Fisher 公司；乙酸、無水硫酸鈉和氯化鈉均為分析純，購自北京化學試劑公司；EUPT-SM12（簡稱“SM12”）和 EUPT-FV22（簡稱“FV22”）樣品由 EUPT 組織方提供。用于方法學評價的洋蔥樣品基質購自本地市場。

儀器和設備采用 Agilent 1290 Infinity II 二元液相色譜系統(tǒng)對農藥化合物進行超高效分離。該色譜系統(tǒng)配備如下安捷倫模塊：1290 Infinity II 二元高壓梯度泵、1290 Infinity II 自動進樣器和 1290 Infinity II 柱溫箱。色譜柱的流出液轉入 Agilent 6545A 四極桿飛行時間質譜儀進行檢測。實驗所用的 Carbon/NH2 固相萃取小柱（500 mg/500 mg，部件號 12252202）為美國安捷倫公司產品，所用色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（100 mm × 2.1 mm, 3.5 μm，部件號861775-902）。

定性篩查EUPT 組織方提供的 SM12 樣品僅要求提供定性篩查結果，F(xiàn)V22樣品則要求基于 EUPT 提供的清單同時提供定性和定量篩查結果。因此，實驗首先對這兩種樣品按上述樣品前處理方法進行處理，得到待測溶液；然后采用液相色譜-四極桿飛行時間質譜平臺在全離子 MS/MS 模式下采集數(shù)據(jù)，對采集得到的結果進行定性篩查。對于 SM12 樣品，依據(jù)實驗室現(xiàn)有的農藥化合物精確質量數(shù)據(jù)庫與譜庫（農藥 PCDL 庫，包含超過 810 種化合物）進行分子式查找，同時選擇碎片離子進行確認。對于 FV22 定量篩查樣品，則在實驗室現(xiàn)有的農藥 PCDL 庫的基礎上，建立針對 FV22 篩查清單的 PCDL 子庫，然后利用該 PCDL 子庫進行母離子（定量離子）查找以及碎片離子確認。定性篩查指標參考SANTE/12682/2019 指南[6] 并進行適當調整，化合物的確認需要滿足以下條件：包括 1 個母離子和至少 1 個碎片離子，且這些離子的質量偏差需要在 10 ppm 以內；母離子與碎片離子共流出，且保留時間與庫中標準物質在相同色譜條件下的保留時間偏差在0.35 min 以內。對于質量偏差在 5–10 ppm 以內的化合物，則需進一步人工查驗確認。方法的篩查限 (SDL) 基于上述篩查指標要求，采用本地市場采購的無陽性檢出的洋蔥樣品作為空白基質，分別以 1、5、10、25和 50 µg/kg 的濃度水平進行 173 種農藥的加標測試。每個濃度水平做 20 組平行實驗，經圖 1 所示的樣品提取與凈化過程，在本文所述的色譜和質譜條件下進行測定，并按上述化合物確認需要滿足的條件進行篩查閾值的設置。如果某個濃度水平下有 95%或以上的樣品中篩查出某種目標化合物，則認為該濃度為此化合物的篩查限。

定量測定對于定量限和線性范圍的確定，首先按照圖 1 制備空白基質，在最后一步溶解殘渣時向其中加入不同濃度的標準溶液，制備成1、5、10、25、50、100、200 μg/kg 的基質匹配標準校正溶液，然后進行樣品測定。選擇分子加合離子峰（母離子）計算 S/N。將 S/N 滿足 ≥ 10 所對應的低加標濃度水平定為目標化合物的定量限 (LOQ)；并以母離子的提取色譜峰面積對添加濃度進行作圖，得到基質匹配標準校正曲線。采用空白洋蔥樣品作為驗證基質，分別在 1 × LOQ、2 × LOQ 和10 × LOQ 三個濃度水平進行加標回收實驗，每個濃度水平平行測定 5 次，用以評估方法的準確度和精密度。對于定性篩查小節(jié)中在 FV22 樣品中定性篩查得到的農藥，以上述基質匹配標準校正曲線對篩查到的農藥進行準確定量。

結果與討論2020 年度歐盟農殘能力驗證中的 FV22 項目是基于歐盟公開的農藥清單（2020 年度的清單包括 208 種強制農藥清單和 36 種自愿農藥清單，共 244 種）的篩查與準確定量。利用本實驗室基于LC-QTOF/MS 平臺所開發(fā)的檢測方法，首先開展針對歐盟清單化合物的定性和定量篩查方法評價。在上述包含 244 種化合物的清單中，利用根據(jù)化合物結構判斷適合電噴霧正離子模式離子化特征的 173 種農藥，對定性和定量篩查方法的性能進行評價。其它71 種化合物適合電噴霧負離子模式離子化或 EI 離子化，不在本文討論的范圍內。

方法的篩查限 (SDL)、定量限 (LOQ) 與標準曲線按照前述篩查限測定的方法，得到 173 種農藥化合物的篩查限如圖 2A 中以“×”標記的數(shù)據(jù)點所示。其中 96.5%（167 種）的農藥的篩查限在 1–5 µg/kg 范圍內，且有 132 種 (76.3%) 農藥的篩查限不高于 1 µg/kg。其余 6 種 (3.5%) 農藥的篩查限相對較高，其中 5 種農藥（保棉磷、丙硫磷、氟胺氰菊酯、甲基立枯磷和仲丁威）的篩查限在 25 µg/kg 的水平，1 種農藥（異噁唑草酮）的篩查限在 50 µg/kg 的水平。表明該方法對于測試清單中適用電噴霧正離子化的絕大部分農藥的篩查靈敏度較高，滿足歐盟對于這些農藥篩查的 10 µg/kg 的一律標準，以及針對個別化合物（例如樂果、氧樂果和毒死蜱等）的更低的標準 (3–5 µg/kg)。173 種農藥的定量限如圖 2A 中以“o”標記的數(shù)據(jù)點所示。從圖中可以看出，上述 SDL 在 1–5 µg/kg 范圍內的 167 種農藥的 LOQ均不高于 10 µg/kg 的一律標準和針對個別化合物的更低的標準；且上述篩查限較高的 6 種農藥中的兩種（保棉磷和仲丁威）的LOQ 在 25 µg/kg 水平，其余 4 種農藥的 LOQ 則不高于 50 µg/kg?；|加標溶液測定的結果表明，所考察的農藥化合物在測定濃度范圍內線性關系良好，超過 90% 的農藥化合物的線性回歸方程決定系數(shù) R2 均大于 0.99，個別化合物的 R2 略低于 0.99，但均大于0.98，如圖 2B 所示。