蛋白質(zhì)保存全知道：穩(wěn)定蛋白質(zhì)活性的科學(xué)指南

蛋白質(zhì)保存全知道：穩(wěn)定蛋白質(zhì)活性的科學(xué)指南

蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)扮演著極為重要的角色，它們參與細(xì)胞的構(gòu)建、催化化學(xué)反應(yīng)、傳遞信號(hào)等多種生理過(guò)程。在實(shí)驗(yàn)室研究、生物技術(shù)應(yīng)用以及生物制藥等領(lǐng)域，蛋白質(zhì)也是關(guān)鍵的研究對(duì)象和生產(chǎn)原料。然而，蛋白質(zhì)在制備、保存和使用過(guò)程中卻面臨著諸多挑戰(zhàn)，如容易出現(xiàn)聚集、沉淀和變性等問(wèn)題，這些問(wèn)題會(huì)嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的活性與功能，進(jìn)而影響相關(guān)研究和應(yīng)用的準(zhǔn)確性與有效性。

一、影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的因素

（一）劇烈刺激

蛋白質(zhì)對(duì)環(huán)境變化較為敏感，pH 值的大幅波動(dòng)、溫度的急劇升降、反復(fù)凍融循環(huán)、攪拌以及過(guò)濾等操作都可能成為破壞蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的 “元兇”。攪拌會(huì)使蛋白質(zhì)暴露于空氣 - 水界面，過(guò)濾則讓其處于液體 - 固體界面，而 pH 值與溫度的劇烈變化更是直接干擾蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的化學(xué)鍵，這些因素綜合起來(lái)極有可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使其原本有序的結(jié)構(gòu)變得松散無(wú)序，最終形成沉淀而失去活性。

（二）氨基酸側(cè)鏈變化

蛋白質(zhì)中的某些氨基酸側(cè)鏈容易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的整體穩(wěn)定性。像甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸、組氨酸和酪氨酸等氨基酸殘基具有較高的氧化敏感性，一旦被氧化，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能便會(huì)受到損害。此外，天冬酰胺和谷氨酰胺殘基的脫酰胺作用以及肽主鏈肽基團(tuán)的切割也較為常見(jiàn)，這些變化會(huì)改變蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的改變甚至喪失。

二、蛋白質(zhì)的保存原則

（一）減少蛋白酶影響

蛋白酶猶如一把 “剪刀”，能夠催化蛋白質(zhì)和多肽的水解反應(yīng)，將它們切割成更小的片段。由于蛋白酶廣泛存在于各種環(huán)境中，在蛋白質(zhì)制備的初始階段就必須考慮如何降低其對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的破壞作用?？梢赃x用蛋白酶缺陷的菌株來(lái)生產(chǎn)蛋白質(zhì)，從源頭上減少蛋白酶的含量；在破菌純化蛋白的第一步就及時(shí)加入蛋白酶抑制劑，抑制胞內(nèi)蛋白酶的活性；同時(shí)，使用經(jīng)過(guò)嚴(yán)格滅菌處理且無(wú)雜質(zhì)污染的槍頭、緩沖液等耗材，避免其他微生物來(lái)源的蛋白酶混入樣品中。值得一提的是，如果目的蛋白以包涵體形式存在，由于其特殊的結(jié)構(gòu)，能夠在一定程度上抵御蛋白酶的攻擊，降低被破壞的風(fēng)險(xiǎn)。

（二）低溫保存

低溫環(huán)境對(duì)于蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)就像是一個(gè) “保護(hù)罩”。低溫能夠顯著降低蛋白質(zhì)分子的熱運(yùn)動(dòng)，減少分子內(nèi)部化學(xué)鍵斷裂的可能性。同時(shí)，低溫還能抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，降低蛋白酶的活性，從而為蛋白質(zhì)的保存創(chuàng)造有利條件。對(duì)于短期保存（1 周以內(nèi)），通常將蛋白質(zhì)置于 4°C 的環(huán)境中較為適宜；而對(duì)于長(zhǎng)期保存（數(shù)月至數(shù)年），則需要更低的溫度，如 -20°C 或 -80°C。不過(guò)需要注意的是，-20°C 冰箱在實(shí)際使用過(guò)程中，由于頻繁開(kāi)關(guān)門，尤其是靠近冰箱門的區(qū)域，溫度波動(dòng)較大，很難穩(wěn)定維持在 -20°C，甚至在無(wú)霜冰箱中還可能出現(xiàn)反復(fù)凍融現(xiàn)象，這對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性極為不利。此外，-20°C 接近某些鹽的共融點(diǎn)，容易導(dǎo)致晶體反復(fù)凍融，進(jìn)而引發(fā)蛋白質(zhì)變性。因此，在條件允許的情況下，-80°C 是更為理想的長(zhǎng)期保存溫度選擇。

（三）分裝保存

蛋白質(zhì)在冷凍保存與使用過(guò)程中存在一個(gè)棘手的問(wèn)題，那就是反復(fù)凍融。每次凍融都會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成一定程度的損傷，導(dǎo)致其活性逐漸喪失或發(fā)生變性。為了減少這種損傷，將純化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行分裝保存是一種有效的策略。一般建議每管分裝 50 至 100 微升，具體可根據(jù)蛋白質(zhì)的濃度以及實(shí)驗(yàn)的實(shí)際需求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，但每管最少不應(yīng)低于 10 微升。在使用時(shí)，僅解凍本次實(shí)驗(yàn)所需的部分，并且盡量控制凍融次數(shù)不超過(guò)兩次。對(duì)于實(shí)驗(yàn)剩余的蛋白質(zhì)，如果短期內(nèi)還會(huì)使用，可暫時(shí)存放在 4°C 冰箱中，但存放時(shí)間不宜超過(guò)一周。

（四）控制濃度

蛋白質(zhì)的濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)引發(fā)一系列問(wèn)題。當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的相互作用增強(qiáng)，容易發(fā)生聚集并沉淀下來(lái)；而當(dāng)濃度過(guò)低（低于 0.1mg/mL）時(shí)，蛋白質(zhì)又會(huì)特異性地吸附在管壁上，造成蛋白質(zhì)的損失，從而影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。因此，在保存蛋白質(zhì)時(shí)，需要將其濃度控制在一個(gè)合適的范圍內(nèi)，一般建議濃度為 1 - 10mg/mL。

（五）速凍與速融

緩慢的冷凍過(guò)程會(huì)使蛋白質(zhì)處于一種極為 “惡劣” 的環(huán)境中，可能會(huì)使其暴露在高鹽濃度高 pH 條件下，這種環(huán)境會(huì)嚴(yán)重破壞蛋白質(zhì)的活性。因此，在冷凍蛋白質(zhì)時(shí)，應(yīng)采用快速冷凍的方法，如使用液氮或干冰 / 乙醇 / 丙酮混合物進(jìn)行速凍，讓蛋白質(zhì)能夠迅速越過(guò)危險(xiǎn)的溫度區(qū)間，減少損傷。同樣，在解凍時(shí)也需要讓蛋白質(zhì)快速恢復(fù)到適宜的鹽濃度和 pH 條件下，例如可以像復(fù)蘇細(xì)胞一樣，將蛋白質(zhì)樣品置于 37°C 的溫水中快速解凍。

（六）合理使用添加劑

在蛋白質(zhì)保存過(guò)程中，添加劑的使用需要謹(jǐn)慎選擇，必須確保所添加的試劑不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的活性產(chǎn)生負(fù)面影響。

緩沖液：緩沖液能夠維持溶液的 pH 值穩(wěn)定，一般選擇 pH 在中性范圍內(nèi)（如 50 mmol/L pH8.0 的 Tris - HCl 或 PBS），鹽濃度在 0 - 150mmol/L 的緩沖液較為合適。合適的緩沖液可以為蛋白質(zhì)提供一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的化學(xué)環(huán)境，減少 pH 值波動(dòng)對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響。

保護(hù)劑：不同的保護(hù)劑具有不同的功能。甘油（濃度為 10% - 50%）可以防止蛋白質(zhì)在冷凍過(guò)程中受到損傷，避免因凍融而導(dǎo)致的變性；Na2N2（濃度為 0.02% - 0.1%）能夠有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，但需要注意的是，Na2N2會(huì)干擾某些抗體蛋白參與的氨基反應(yīng)，在這種情況下，可以使用 0.01% 的硫柳汞來(lái)替代；PMSF 作為一種蛋白酶抑制劑，可以防止蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的降解作用；DTT 則是一種還原劑，能夠防止蛋白質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)。然而，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，由于Na2N2和硫柳汞可能對(duì)生物體產(chǎn)生毒性，因此不可添加這兩種物質(zhì)，通常采用過(guò)濾除菌的方法來(lái)保證蛋白質(zhì)溶液的無(wú)菌性。

三、蛋白質(zhì)的保存策略

（一）液體狀態(tài)下不凍結(jié)保存

在液體狀態(tài)下短期保存蛋白質(zhì)時(shí)，可以將溫度控制在 2 - 8°C，在這個(gè)溫度區(qū)間內(nèi)，蛋白質(zhì)能夠保持相對(duì)穩(wěn)定，減少聚集沉淀的發(fā)生，但需要注意的是，即使在這個(gè)溫度下，蛋白質(zhì)仍然會(huì)發(fā)生緩慢的化學(xué)降解反應(yīng)。為了進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，需要調(diào)節(jié)溶液的 pH 值，使其維持在 5.5 - 7.5 的穩(wěn)定范圍內(nèi)。此外，由于蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的去折疊傾向，可以添加一些非特異性穩(wěn)定劑，如 0.5M 的蔗糖，它能夠與蛋白質(zhì)分子相互作用，增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。還可以添加硫酸銨、甘氨酸、聚乙二醇、蔗糖等添加劑，這些添加劑通過(guò)優(yōu)先排阻的方法維持蛋白質(zhì)的熱力學(xué)穩(wěn)定性，其中檸檬酸鹽緩沖液（在不存在鈣離子的情況下）效果較為顯著。溶液中離子的電荷屏蔽作用能夠降低蛋白質(zhì)分子間的電荷 - 電荷排斥作用，但離子濃度的選擇需要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。

（二）凍結(jié)溫度下保存

在選擇凍結(jié)溫度保存蛋白質(zhì)時(shí)，-80°C 相較于 -20°C 具有明顯優(yōu)勢(shì)。-80°C 能夠更大程度地降低蛋白質(zhì)的降解速率，為蛋白質(zhì)提供更好的長(zhǎng)期保存條件。而 -20°C 冰箱由于其自身特點(diǎn)，如頻繁開(kāi)關(guān)門導(dǎo)致溫度不穩(wěn)定，特別是在無(wú)霜冰箱中易出現(xiàn)反復(fù)凍融現(xiàn)象，且接近某些鹽的共融點(diǎn)，容易造成晶體反復(fù)凍融，從而引起蛋白質(zhì)變性。在緩沖液的選擇上，由于低溫下堿性鹽容易結(jié)晶，酸性鹽仍可溶解，冷凍時(shí)磷酸鹽緩沖液 pH 值會(huì)大幅下降，這可能導(dǎo)致許多蛋白質(zhì)發(fā)生變性。因此，應(yīng)優(yōu)先選擇檸檬酸鹽、Tris、組氨酸等緩沖液，以減少 pH 值變化對(duì)蛋白質(zhì)的影響。同時(shí)，加入甘油、鹽析鹽、二糖（濃度高于 0.3M）、表面活性劑（濃度低至 0.1%）等保護(hù)劑，能夠有效防止蛋白質(zhì)在冷凍過(guò)程中發(fā)生變性和沉淀；添加百分之幾的 BSA 或聚合物也可以抑制冷凍引起的蛋白質(zhì)去折疊；適當(dāng)增加蛋白質(zhì)的起始濃度，能夠增強(qiáng)其在凍融過(guò)程中對(duì)損傷的耐受性。

（三）凍干保存

凍干是一種較為特殊且有效的蛋白質(zhì)保存方法，它通過(guò)將溶劑或懸浮介質(zhì)在低溫下冷凍，然后使固態(tài)的溶劑直接升華為氣態(tài)，從而去除水分，得到干燥的蛋白質(zhì)樣品。這種方法能夠很好地保持蛋白質(zhì)物質(zhì)骨架的穩(wěn)定性，并且在復(fù)融后其結(jié)構(gòu)和功能基本不發(fā)生改變。凍干過(guò)程主要包括預(yù)凍結(jié)、升華干燥和解析干燥三個(gè)階段。在凍干過(guò)程中，添加必要的穩(wěn)定劑對(duì)于防止蛋白質(zhì)變性至關(guān)重要，其中非還原型的海藻糖和蔗糖（濃度為 200 - 300mM）作為穩(wěn)定劑對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)較好。需要注意的是，應(yīng)避免使用還原型糖，如葡萄糖、麥芽糖、乳糖等，因?yàn)樗鼈儠?huì)引發(fā)美拉德（Maillard）反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解。目前，商業(yè)化的蛋白質(zhì)凍干產(chǎn)品通常采用添加海藻糖 5%、甘露醇 5%、tween - 80 0.01% 的方法來(lái)保護(hù)蛋白質(zhì)。然而，凍干方法也存在一些不足之處，例如凍干設(shè)備復(fù)雜且昂貴，這使得凍干成本較高；某些蛋白質(zhì)在凍干后可能無(wú)法全復(fù)溶，或者在凍干 / 復(fù)溶過(guò)程中會(huì)受到損傷，導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性下降。因此，凍干通常作為蛋白質(zhì)保存的最后選擇，只有在其他保存方法無(wú)法滿足需求時(shí)才考慮使用。

四、蛋白質(zhì)保存的注意事項(xiàng)

（一）SDS - PAGE 檢測(cè)

在蛋白質(zhì)保存過(guò)程中，如果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)活性有所下降或丟失，首先應(yīng)進(jìn)行 SDS - PAGE 跑膠檢測(cè)。SDS - PAGE 是一種常用的蛋白質(zhì)分析技術(shù)，它能夠根據(jù)蛋白質(zhì)分子的大小將其分離，通過(guò)跑膠結(jié)果可以直觀地觀察蛋白質(zhì)是否發(fā)生了降解，從而幫助我們初步判斷蛋白質(zhì)活性丟失的原因，為后續(xù)采取相應(yīng)的措施提供依據(jù)。

（二）無(wú)菌操作

我們的皮膚表面存在著各種蛋白酶以及其他化學(xué)物質(zhì)，這些物質(zhì)很容易污染蛋白質(zhì)樣品，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和活性。因此，在進(jìn)行蛋白質(zhì)相關(guān)操作時(shí)，務(wù)必戴上手套，避免皮膚直接接觸蛋白質(zhì)溶液；同時(shí)，使用經(jīng)過(guò)滅菌處理的小管來(lái)保存蛋白質(zhì)，防止微生物污染，確保蛋白質(zhì)處于一個(gè)無(wú)菌的環(huán)境中。

（三）避免震蕩

震蕩過(guò)程中產(chǎn)生的剪切力以及氣泡中的氧氣會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)造成雙重傷害。剪切力可能破壞蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，而氧氣則容易引發(fā)蛋白質(zhì)的氧化反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的活性喪失。因此，在蛋白質(zhì)的制備、保存和使用過(guò)程中，應(yīng)盡量避免劇烈震蕩，保持操作的平穩(wěn)性。

蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性對(duì)于眾多生物學(xué)研究和生物工程應(yīng)用具有舉足輕重的意義。了解影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的各種因素，并遵循科學(xué)合理的保存原則、策略以及注意事項(xiàng)，能夠幫助我們有效地保持蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)穩(wěn)定，延長(zhǎng)其保存時(shí)間，確保蛋白質(zhì)在研究和應(yīng)用中發(fā)揮其應(yīng)有的作用。

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