巨噬細胞極化通過調(diào)控細胞增殖、炎癥介質(zhì)與細胞外基質(zhì)代謝來調(diào)節(jié)椎間盤退變

Macrophage polarization regulates intervertebral disc degeneration by modulating cell proliferation, inflammation mediator secretion, and extracellular matrix metabolism

Keywords: inflammation; intervertebral disc degeneration (IDD); low back pain; macrophage polarization; musculoskeletal disorder; nucleus pulposus cells (NPCs).

椎間盤退變（IDD）過程與合成代謝和分解代謝之間平衡穩(wěn)態(tài)的轉(zhuǎn)變有關(guān)，因此，它導(dǎo)致細胞外基質(zhì)（ECM）組分的分泌減少，特別是聚集蛋白聚糖和II型膠原纖維蛋白，并增強基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達。此外，IDD 的進展伴隨著各種促炎細胞因子水平的顯著升高，包括白細胞介素（IL）-1α 、IL-6、IL-8 和 IL-12 以及腫瘤壞死因子（TNF）-α。因此，促進 ECM 成分的分泌以及抗炎反應(yīng)是對抗 IDD 的關(guān)鍵。

在 IDD 中，由于免疫平衡被纖維環(huán)破裂或終板微骨折破壞，巨噬細胞浸潤和極化發(fā)生。越來越多的細胞共培養(yǎng)模型發(fā)現(xiàn)，髓核細胞（NPCs）和巨噬細胞可以改變炎癥因子的表達，如炎癥相關(guān)基因（IL-1β、IL-6 和 Ccl3）和 ECM 代謝相關(guān)基因（MMP13 和 Acan）。根據(jù)對微環(huán)境刺激的反應(yīng)，巨噬細胞分為經(jīng)典活化的M1巨噬細胞和交替活化的M2巨噬細胞。然而，巨噬細胞極化對 NPCs 的作用及其在 IDD 中的潛在機制尚未明確。

鑒于此，廣東省高州市人民醫(yī)院骨外科課題組曾在一項研究中，探討了人 IDD 樣本中巨噬細胞極化標志物的表達，并在細胞共培養(yǎng)模型中測試了它們對 NPCs 的生物學(xué)效應(yīng)，還進行了差異表達基因（DEGs）的鑒定和通路分析，以闡釋巨噬細胞極化的生物學(xué)作用，探索與 IDD 相關(guān)的潛在分子靶點和信號通路。研究成果發(fā)表在 Frontiers in Immunology 期刊題為“Macrophage polarization regulates intervertebral disc degeneration by modulating cell proliferation, inflammation mediator secretion, and extracellular matrix metabolism”。

首先，利用免疫組化分析評估了退行性椎間盤（IVD）組織中巨噬細胞的積累和極化，測定了對照（Pfirrmann I 級）和退變樣本（Pfirrmann IV 級）中M1和M2巨噬細胞標志物CCR7和CD206（圖1 A）。與對照組相比，裂縫或肉芽 IDD 組織樣本顯示更高的 CCR7（M1 樣巨噬細胞標志物）陽性細胞計數(shù)（圖1 B、C），且M2 樣巨噬細胞標志物 C206+ 陽性細胞的比例也顯著升高（圖1 D、E）。這表明，與正常對照相比，IDD 患者 IVD 退變組織中 M1 和 M2 極化巨噬細胞均有浸潤和累積。

圖1    巨噬細胞在人IVD組織中的積累和極化。（F）條件培養(yǎng)基（CM）的收獲流程及體外、體內(nèi)條件培養(yǎng)基的分組過程。對于細胞共培養(yǎng)模型，將 NPCs 分為 5 組：第1組以 10% FBS 培養(yǎng)基處理為對照，第2組以 10 ng/mL TNF-α 為陰性組，第3-5組分別以 10 ng/mL TNF-α 和 30% M0CM、M1CM、M2CM 作為共培養(yǎng)組。

接下來，通過 EDU 摻入和 CCK-8 測定分析了 NPC 的增殖。結(jié)果顯示，對照組、TNF-α-、M0CM+ TNF-α-、M1CM+ TNF-α-和M2CM+ TNF-α-組在24 h和48 h時EDU陽性細胞百分比和光密度（OD）值均無顯著差異，然而，在 72 h和 96 h時，TNF-α處理組在兩個測試中均顯示 NPC 增殖降低（圖2）。在檢測 TNF-α 環(huán)境中 EDU 陽性細胞的比例時，M1CM 共培養(yǎng)呈抑制趨勢，而 M2CM 共培養(yǎng)呈促進趨勢，96 h 時該比例顯著高于 TNF-α處理組（圖2 B）。同樣，在 TNF-α 處理后，M2CM 共培養(yǎng)顯示 NPC 細胞增殖增加，而 M1CM 共培養(yǎng)顯示出相反的結(jié)果（圖2 C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，M1CM 抑制了細胞增殖，而 M2CM 逆轉(zhuǎn)了這種作用。

此外，通過免疫熒光分析了NPCs中II型膠原的表達。實驗觀察到，與對照組相比，TNF-α 處理降低了 OD 值。與 TNF-α處理組相比，M1CM 共培養(yǎng)組顯示 OD 值明顯降低，而 M2CM 共培養(yǎng)組顯示 OD 值增加。同時，蛋白質(zhì)印跡分析顯示合成代謝蛋白Aggrecan（聚集蛋白聚糖）在 TNF-α 環(huán)境中表現(xiàn)出相同的趨勢，相反，分解代謝蛋白 MMP-13 在 M1CM 組中表達更高，M2CM 組表達較低。相對于對照組，TNF-α處理組編碼Aggrecan和COL2a1的 ECM 相關(guān)基因的表達顯著下調(diào)，而 M2CM 顯著上調(diào)其表達水平。相比之下，M1CM+ TNF-α 組COL1a1和 MMP-13 表達上調(diào)，而 M2CM 共培養(yǎng)組在這方面呈下降趨勢。所有 TNF-α處理組的 IL-1β、IL-6 和 IL12 基因表達水平均顯著高于對照組。與 TNF-α處理的 NPCs 相比，M1CM 共培養(yǎng)的 NPCs 顯示 IL-1β、IL-6 和 IL12 基因表達水平顯著上調(diào)，而M2CM 共培養(yǎng)的 NPCs 均顯著下調(diào)其水平。這些結(jié)果表明，M1CM 處理減弱了 IDD 中 ECM 合成并促進了促炎介質(zhì)的分泌，而在 M2CM 處理的情況下觀察到相反的趨勢。

圖2    巨噬細胞極化對TNF-α-處理環(huán)境下NPCs增殖的影響。

為了進一步評估不同 CMs 對 IDD 進展的治療效果，對大鼠 IDD 模型進行局部CM 注射。8 周后，陰性對照（NC）組形態(tài)紊亂，髓核（NP）在椎間盤區(qū)域明顯變窄，M1CM 注射后 NP 組織質(zhì)量以及外纖維環(huán)（AF）薄板破壞呈加重趨勢，退變相關(guān)變化明顯嚴重，而M2CM 可以明顯抑制這種與退變相關(guān)的變化。通過 X 射線分析獲得椎間盤高度指數(shù)（DHI）值，發(fā)現(xiàn)M1CM 注射導(dǎo)致 DHI 持續(xù)降低，而 M2CM 注射相對于 NC 組在整個實驗期間顯著抑制了這種 DHI% 的下降趨勢。這表明，M1CM注射促進了IDD進展，而M2CM處理則表現(xiàn)出相反效果。

然后，還評估了巨噬細胞極化對椎間盤基質(zhì)的影響。免疫組化染色顯示，未穿刺的 IVD 空白對照（BC）組對應(yīng)的 AF 和 NP 對II 型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖呈強陽性，然而，NC 組在穿刺后 8 周染色強度顯著降低（圖3 B、C）。此外，M1CM 下調(diào)II 型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖的表達，然而這種效果被 M2CM 處理抑制（圖3 B、C），基因表達分析結(jié)果與此一致（圖3 D、E）。

此外，穿刺后 8 周 ECM 分解代謝和促炎介質(zhì)相關(guān)基因的表達分析顯示，NC 組相對于 BC 組 MMP13 顯著上調(diào)（圖3 F）。相較于NC 組，M1CM 組 MMP13 mRNA 水平和促炎介質(zhì) IL-1、IL-6 和 IL-12 的表達水平均升高，而M2CM 組表達水平均呈相反趨勢（圖3 F-I）。這些數(shù)據(jù)表明，M1CM 對 IDD 具有破壞性作用，而 M2CM 可以減輕這種影響。

圖3    巨噬細胞極化對大鼠尾骨IVDs ECM代謝及促炎介質(zhì)分泌的影響。

最后，研究人員對TNF-α環(huán)境下與巨噬細胞共培養(yǎng)的NPCs進行了差異表達基因（DEGs）鑒定。與 TNF-α 組比較，M1CM+ TNF-α 組共檢測到637 個上調(diào)基因和 655 個下調(diào)基因，其中上調(diào)最多的是ETS 同源因子（EHF），下調(diào)最多的是殼多糖酶3樣蛋白1（CHI3L1）；M2CM+ TNF-α 組共檢測到 975 個上調(diào)基因和 930 個下調(diào)基因，其中上調(diào)最多的是 EHF，下調(diào)最多的是 Homo_sapiens_newGene_100589。

通過GO和KEGG通路富集分析，還在兩組中檢測到細胞器裂變、核分裂和染色體分離等多個GO terms 富集，其中 KEGG 通路分析中最重要的通路是細胞周期。此外，M2CM 組含膠原的細胞外基質(zhì)、DNA催化活性和細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分均高度富集。這與上述結(jié)果相吻合，即 M2CM 通過抑制 TNF-α誘導(dǎo)的 ECM 降解來減緩 IDD，表明其具有促進 ECM 合成的潛力。

通過構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)鑒定中心基因（hub基因）發(fā)現(xiàn)，在M1CM組中，較顯著的5個中心基因分別是PLK1、KIF20A、RRM2、CDC20和UBE2C；M2CM組中較顯著的5個中心基因分別是RRM2、CDC20、CCNB1、PLK1和UBE2C。這些生物信息學(xué)分析鑒定表明其是與IDD相關(guān)的中心基因，可為治療IDD提供研究方向。

圖4     M1 和 M2 巨噬細胞在 IDD 過程中的作用和潛在機制。巨噬細胞主要以極化的M1 和 M2 參與 IDD，而不是以其自身。具體而言，M1CM 抑制細胞增殖并加劇 IVD 退變，而 M2CM 促進細胞增殖并減弱 IDD 的發(fā)展。在 M1CM 處理的 NPCs 中共鑒定出 1038 個 DEGs，在 M2CM 組中共鑒定出 1905 個 DEGs。細胞周期是 KEGG 富集較顯著的通路，在兩種處理的 NPCs 中，細胞器裂變、核分裂和染色體分離均在 GO 功能中高度富集。最后，M1CM 組最重要的 5 個基因為 PLK1、KIF20A、RRM2、CDC20 、UBE2C；M2CM 組為 RRM2、CCNB1、CDC20、PLK1 和 UBE2C。

總之，巨噬細胞極化在 IDD 進展中發(fā)揮了不同的作用，M1CM 抑制了細胞增殖，加劇了 IVD 退變，而 M2CM 則減緩了 IDD 的發(fā)展。這些發(fā)現(xiàn)可能有助于進一步闡明巨噬細胞極化在 IDD 中的作用，并為巨噬細胞的治療潛力提供新的見解。

參考文獻：Li XC, Luo SJ, Fan W, Zhou TL, Tan DQ, Tan RX, Xian QZ, Li J, Huang CM, Wang MS. Macrophage polarization regulates intervertebral disc degeneration by modulating cell proliferation, inflammation mediator secretion, and extracellular matrix metabolism. Front Immunol. 2022 Aug 18;13:922173. doi: 10.3389/fimmu.2022.922173. PMID: 36059551; PMCID: PMC9433570.

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