PCR基因擴(kuò)增儀應(yīng)用詳細(xì)說明

一、原理

　　PCR技術(shù)的本質(zhì)是體外核酸擴(kuò)增，加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復(fù) “變性→退火→引物延伸”過程至25～40個(gè)循環(huán)，呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)大待測(cè)樣本中的核酸拷貝數(shù)。

二、分類

1. 普通的PCR儀

　　一次PCR擴(kuò)增只能運(yùn)行一個(gè)特定退火溫度的PCR儀，又叫傳統(tǒng)的PCR儀。

　　用途：主要是做一些簡(jiǎn)單的、對(duì)單一退火溫度的目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。

　?。?）梯度PCR儀： 一次PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件(溫度梯度)，通常為12種溫度梯度的普通PCR儀。

　　用途：研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增。

　　（2）原位PCR：將具有細(xì)胞定位能力的原位雜交技術(shù)運(yùn)用于從細(xì)胞內(nèi)靶DNA的定位分析，在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因擴(kuò)增的普通PCR儀。

　　用途：用于在細(xì)胞的靶DNA所在位置上進(jìn)行基因擴(kuò)增。

2. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀

　　PCR擴(kuò)增時(shí)加入的引物利用熒光素進(jìn)行標(biāo)記，使引物和熒光探針同時(shí)與模板進(jìn)行特異性結(jié)合，擴(kuò)增結(jié)果通過熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集信號(hào)并輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，實(shí)時(shí)輸出量化結(jié)果，這樣的PCR儀叫實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

　?。?）金屬板式實(shí)時(shí)定量PCR儀

　　可作為普通PCR儀使用

　　可帶梯度功能

　　可容納的樣本量大，無需特殊耗材

　　溫度均一性欠佳，有邊緣效應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)條件難以做到與樣品全一致

　　（2）離心式實(shí)時(shí)定量PCR儀

　　溫度均一性較好

　　使用的是同一個(gè)激發(fā)光源和檢測(cè)器，隨時(shí)檢測(cè)旋轉(zhuǎn)到跟前的樣品，有效減少系統(tǒng)誤差

　　可容納樣品量少，有的需用特殊毛細(xì)管作樣品管，增加了使用成本，也不帶梯度功能

　?。?）各孔獨(dú)立控溫的定量PCR儀

　　不同樣品槽分別擁有獨(dú)立的智能升降溫模塊，各孔獨(dú)立控溫，適合多指標(biāo)快速檢測(cè)。

　　SmartCyclerⅡ的軟件允許一臺(tái)儀器同時(shí)操作六個(gè)樣品模塊，既滿足高速批量要求，又能靈活運(yùn)用，還可實(shí)現(xiàn)任意梯度反應(yīng)。

　　SmartCyclerⅡ上樣不如傳統(tǒng)方法方便，而且需要有的扁平反應(yīng)管，使用成本較高。

三、操作規(guī)程

　　普通PCR擴(kuò)增儀的操作非常簡(jiǎn)便，接通電源，儀器自檢，設(shè)置溫度程序或調(diào)出儲(chǔ)存的程序運(yùn)行即可。

　　定量PCR擴(kuò)增儀的操作和普通PCR儀基本相同。

四、常見故障

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　?、赑CR管融化，原因可能是溫度傳感器出問題或是熱蓋出問題；

　?、蹅€(gè)別孔擴(kuò)增效率差異很大，可能的原因是半導(dǎo)體模塊出現(xiàn)壞點(diǎn)；

　?、軣晒鈴?qiáng)度減弱或不穩(wěn)定，產(chǎn)生的原因有濾光片發(fā)霉或有水汽，或光源損耗（以鹵鎢燈為光源的），需更換光源；或需調(diào)節(jié)檢測(cè)元件靈敏度；

　?、輧x器工作時(shí)出現(xiàn)噪音。

　　以上故障部分可自行檢查，部分需工程師檢修。