機(jī)械敏感的多囊蛋白1促進(jìn)骨膜干/祖細(xì)胞在骨折愈合中的骨軟骨分化

Mechanosensitive protein polycystin-1 promotes periosteal stem/progenitor cells osteochondral differentiation in fracture healing

Keywords: Fracture healing; Mechanical stress; Periosteal Stem/Progenitor Cells; Polycystin-1.

骨膜干/祖細(xì)胞（PSPCs）具有多向分化潛能和自我更新能力，在骨折愈合中起關(guān)鍵作用。值得注意的是，適度的生物力學(xué)環(huán)境有利于PSPC功能和骨折愈合，適度的機(jī)械力促進(jìn) PSPC 介導(dǎo)的愈傷組織形成，而機(jī)械卸載導(dǎo)致 PSPC 功能障礙、異常骨痂形成，并最終延遲愈合或不愈合。目前已經(jīng)確定了骨折愈合過程中標(biāo)記 PSPC 的幾種標(biāo)志物，包括組織蛋白酶K（Ctsk）、PDGFRα 和 Prrx1。

多囊蛋白1（PC1）是一種由 Pkd1 基因編碼的大跨膜蛋白，其胞外結(jié)構(gòu)域充當(dāng)機(jī)械刺激的傳感器，而胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可與 PC2 和 TAZ 形成復(fù)合物，將信號傳遞到細(xì)胞，因此表現(xiàn)出與眾不同的功能。在成骨細(xì)胞譜系的早期階段，Pkd1 的選擇性失活表現(xiàn)出成骨受損和嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松表型，然而，PC1 在皮質(zhì)骨穩(wěn)態(tài)或骨再生中的作用尚未確定。

基于此，中南大學(xué)湘雅醫(yī)院李長俊/羅湘杭教授團(tuán)隊(duì)在 Theranostics 雜志發(fā)表了題為“Mechanosensitive protein polycystin-1 promotes periosteal stem/progenitor cells osteochondral differentiation in fracture healing”的研究成果。在這項(xiàng)研究中，他們證明了CTSK+ PSPCs 可以感知機(jī)械應(yīng)力并通過 PC1 調(diào)節(jié)骨軟骨生成和骨修復(fù)。機(jī)制研究表明，PC1 通過 PC1-CTT 裂解促進(jìn)轉(zhuǎn)錄共激活因子 TAZ 的核易位，并在調(diào)節(jié) PSPCs 的骨軟骨分化中發(fā)揮重要作用，且應(yīng)用專門靶向 PC1-TAZ 軸的小分子 Zinc01442821 改善了機(jī)械卸載引起的延遲愈合。這些發(fā)現(xiàn)表明，靶向該軸可能是一種增強(qiáng)機(jī)械卸載中骨折愈合的很有希望的治療策略。

首先，通過分析骨折后不同時間點(diǎn)后肢去負(fù)荷（HU）小鼠模型的愈合過程，探討骨折愈合的力學(xué)調(diào)控，發(fā)現(xiàn) HU 組小鼠在骨折20 天后出現(xiàn)骨折不愈合，愈傷組織指數(shù)（CI）降低，軟骨形成顯著受損，軟骨島變小和骨折部位編織骨面積減少，這表明機(jī)械卸載誘導(dǎo)骨折修復(fù)延遲。

對骨折部位愈傷組織的單細(xì)胞 RNA 測序（scRNA-seq）分析表明，其中的 PSPCs 反應(yīng)早且迅速，是骨折愈合過程中形成軟骨愈傷組織的主要來源。隨后比較了先前鑒定的標(biāo)記 PSPCs 的標(biāo)志物，包括Ctsk、Prrx1、Pdgfrα、Pdgfrβ、LepR、Mx1、Nes 和 Gli1，發(fā)現(xiàn) Ctsk-陽性 PSPCs 的比例最高，并且在骨折后急劇增加，這意味著CTSK+ PSPC 可能是參與骨折愈合的主要源頭。

為了更好地理解CTSK+ PSPCs 在骨折愈合中的作用，比較了 Ctsk-陽性或 Ctsk-陰性 PSPCs 中的差異表達(dá)基因（DEGs）。GO 分析顯示，這些 DEGs 與機(jī)械刺激反應(yīng)相關(guān)，表明 Ctsk-陽性 PSPCs 可能代表骨折后對機(jī)械刺激反應(yīng)的主要細(xì)胞亞群。因此，接下來選擇使用CTSK+ 細(xì)胞研究骨折修復(fù)過程中機(jī)械刺激對 PSPC 功能的影響。使用骨鈣素（OCN）抗體的原位熒光染色顯示，HU小鼠愈傷組織中OCN-陽性 GFP+ PSPCs顯著減少，Ctsk+ PSPCs 顯示 II 型膠原蛋白（ColII）熒光強(qiáng)度降低。這些數(shù)據(jù)表明，Ctsk+ PSPCs 對機(jī)械敏感，其成骨和軟骨形成能力因骨折愈合過程中的機(jī)械卸載而受損。

進(jìn)一步分析HU組和對照組骨愈傷組織中機(jī)械感應(yīng)相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)除了 Pkd2、Fak 和 Conexin43 之外，Pkd1（PC1 的編碼基因）的表達(dá)在機(jī)械卸載時顯著下調(diào)（圖1 A）。同時，HU組骨愈傷組織在第 7 和 10 天 PC1 水平顯著降低（圖1 B、C）。對Ctsk-Cre；YFP+/+ 小鼠骨折愈傷組織進(jìn)行 PC1 免疫熒光染色，觀察到HU處理組愈傷組織區(qū)域中 Ctsk-陽性細(xì)胞的 PC1 水平顯著降低（圖1 D、E）。

為了驗(yàn)證機(jī)械應(yīng)力對體外 PSPC 功能和 PC1 水平的直接影響，對分離的原代 PSPCs 進(jìn)行流體剪切應(yīng)力（FSS）刺激，發(fā)現(xiàn) FSS 處理的 PSPCs 中的 Pkd1 水平增加（圖1 G）。PSPCs 的骨軟骨形成能力也隨著 Cola2-1、Acan（軟骨形成標(biāo)志物）（圖1 F、H）和 Runx2、ALP 和 Sp7（成骨標(biāo)志物）（圖1 I、J）表達(dá)水平的增加而增強(qiáng)。這些數(shù)據(jù)顯示了 PSPCs 中響應(yīng)不同機(jī)械刺激的 PC1 水平變化。

圖1     機(jī)械刺激影響Ctsk+ PSPCs中 PC1水平。

接下來，構(gòu)建 Pkd1-Ctsk-CKO 小鼠（Pkd1^flox/flox 小鼠為對照）研究 Pkd1 在CTSK+ PSPCs 功能和皮質(zhì)骨形成中的作用。CTSK+ PSPCs 中Pkd1 的缺失導(dǎo)致股骨皮層明顯變薄（圖2 A、B），皮質(zhì)骨表面 OCN-陽性成骨細(xì)胞數(shù)量減少（圖2 C、D）。H&E 染色還證實(shí) Pkd1-Ctsk-CKO 小鼠的皮質(zhì)骨體積低于對照組（圖2 E）。這些結(jié)果表明，CTSK+ 祖細(xì)胞/干細(xì)胞中Pkd1 對于皮質(zhì)骨形成和穩(wěn)態(tài)是關(guān)鍵的，且 Pkd1 的特異性缺失可導(dǎo)致皮質(zhì)厚度減少。

通過將 Pkd1 siRNA 轉(zhuǎn)染到 PSPCs 進(jìn)一步驗(yàn)證了 Pkd1 對 PSPCs的直接影響（圖3 F），隨后又評估了骨軟骨形成特征，發(fā)現(xiàn)用 Pkd1 siRNA 轉(zhuǎn)染的 PSPCs 顯示成骨基因（Runx2、Alp 和 Bglap）（圖2 G-J）和軟骨生成基因（Coll0a-1、Col2a1 和 Acan）（圖2 K-N）表達(dá)降低。這些結(jié)果表明，PC1 對于 PSPCs 的骨軟骨分化和皮質(zhì)骨形成是很重要的。

此外，CTSK+ PSPCs 中Pkd1 的缺失減少了愈傷組織的大小和骨化。同時，組織學(xué)分析表明，Pkd1-Ctsk-CKO 軟骨愈傷組織體積減小、骨形成受損，骨小梁減少，OCN+ 成骨細(xì)胞數(shù)量較低。這表明，PSPCs 中 Pkd1 的缺失對骨愈合有不利影響。

為了評估 PC1 是否介導(dǎo)機(jī)械卸載對骨折愈合和 PSPC 功能的影響，對Pkd1-Ctsk-CKO 和 WT 小鼠的HU模型進(jìn)行了骨折處理。與機(jī)械卸載下WT 小鼠中觀察到的延遲骨折愈合相比，Pkd1-Ctsk-CKO 小鼠未觀察到愈傷指數(shù)的顯著差異及愈傷組織體積和 OCN+ 成骨細(xì)胞數(shù)量的進(jìn)一步減少。這些發(fā)現(xiàn)表明，Pkd1 缺失后，CTSK+ PSPCs 的機(jī)械傳感能力顯著降低，最終導(dǎo)致 Pkd1-Ctsk-CKO 小鼠對卸載相關(guān)骨折表型產(chǎn)生耐藥性，這為 Pkd1 在骨折愈合過程中 PSPCs 機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用提供了有力的證據(jù)。

圖2    Ctsk+ PSPCs中Pkd1缺失會損害骨形成。

PC1 的 C 端尾部（CTT）將細(xì)胞外機(jī)械刺激線索轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)部，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控。因此，實(shí)驗(yàn)在 PSPCs 中過表達(dá) PC1-CTT 并測試了骨軟骨分化能力，確認(rèn)了PC1-CTT 過表達(dá)促進(jìn)了 PSPCs 的骨軟骨分化。隨后使用限制 PC1-CTT 裂解和釋放的γ分泌酶抑制劑（ DAPT）發(fā)現(xiàn)PSPCs 顯示骨軟骨生成相關(guān)基因表達(dá)的降低和軟骨細(xì)胞分化受損。體外數(shù)據(jù)顯示，在不存在 Pkd1 的情況下，PC1-CTT 的過表達(dá)增強(qiáng)了 PSPCs 的骨軟骨分化，且DAPT 抑制了成骨。

以往研究表明，PC1與轉(zhuǎn)錄輔激活因子TAZ相互作用，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化。因此，實(shí)驗(yàn)將 Taz siRNA 轉(zhuǎn)染到 PSPCs 中，并分析其向成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化。Taz 敲低抑制了 PSPCs 的骨軟骨形成相關(guān)基因表達(dá)和分化能力。此外，機(jī)械卸載抑制了 TAZ 在HU組 WT 小鼠愈傷組織中的核易位。這些結(jié)果表明，PC1-CTT 裂解促進(jìn)了 TAZ 的核易位，促進(jìn)了 PSPCs 的骨軟骨分化潛力。

最后，研究人員用 Zinc01442821 局部治療小鼠骨折部位 42 天，并研究其在卸載條件下對骨折修復(fù)的治療效果，發(fā)現(xiàn)Zinc01442821 增加了骨折部位的骨密度并改善了礦化愈傷組織的形成（圖3 A），并在 14 和 42 天的骨折部位出現(xiàn)明顯的硬愈傷組織（圖3 A-D）。與對照組相比，用 Zinc01442821 處理的小鼠表現(xiàn)出新生的編織骨大小和密度的顯著增加（圖3 E、F）。此外，Zinc01442821 處理促進(jìn)了 PSPCs 的成骨分化（圖3 G）和軟骨基質(zhì)形成（圖3 H），并增強(qiáng) TAZ 的核易位（圖3 I、J）。這些數(shù)據(jù)表明，施用 Zinc01442821 可以緩解與機(jī)械卸載相關(guān)的骨延遲愈合或不愈合。

體外細(xì)胞測定還發(fā)現(xiàn) Pkd1 的敲低減弱了 Zinc0144282 對 PSPC 成骨分化的積極作用，這表明了Pkd1 的敲低削弱了 Zinc01442821 的治療效果，凸顯了 PC1 在 Zinc01442821 治療中關(guān)鍵的作用。

圖3    Zinc01442821促進(jìn)PSPCs的骨軟骨形成，緩解卸載相關(guān)骨折不愈合。

圖4    圖形概要

總之，該研究結(jié)果表明，CTSK+ PSPCs 可以直接感知機(jī)械應(yīng)力并通過 PC1-TAZ 軸操縱骨軟骨生成和骨愈合，這可能是促進(jìn)骨愈合和礦化組織/器官中其他與機(jī)械應(yīng)力相關(guān)疾病的有希望的治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Liu R, Jiao YR, Huang M, Zou NY, He C, Huang M, Chen KX, He WZ, Liu L, Sun YC, Xia ZY, Quarles LD, Yang HL, Wang WS, Xiao ZS, Luo XH, Li CJ. Mechanosensitive protein polycystin-1 promotes periosteal stem/progenitor cells osteochondral differentiation in fracture healing. Theranostics. 2024 Apr 8;14(6):2544-2559. doi: 10.7150/thno.93269. PMID: 38646641; PMCID: PMC11024844.

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