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熒光定量PCR儀的核心在于利用熒光信號(hào)來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR過(guò)程中DNA或RNA樣本的擴(kuò)增情況，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的精確定量分析。在熒光定量PCR中，首先需要將待測(cè)樣本與特異性引物、DNA聚合酶以及熒光基團(tuán)或熒光標(biāo)記的探針混合，形成一個(gè)反應(yīng)體系。然后，通過(guò)設(shè)定特定的PCR程序，如退火溫度、延伸時(shí)間等，使得DNA片段在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)過(guò)程中，每當(dāng)一個(gè)DNA片段被擴(kuò)增時(shí)，與之結(jié)合的熒光基團(tuán)或探針就會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)。熒光定量PCR儀通過(guò)高靈敏度的熒光檢測(cè)系統(tǒng)，實(shí)時(shí)收集并分析這些熒光信號(hào)，將其轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，從而精確地反映出PCR產(chǎn)物的生成量。
一、操作步驟
打開(kāi)電腦和熒光定量PCR儀的軟件，設(shè)置PCR儀各通道的光電倍增器(PMT)電壓。
將需要擴(kuò)增的樣品模板、引物、探針和內(nèi)參照熒光探針?lè)謩e加入到樣品孔和試劑孔中。
加入PCR擴(kuò)增試劑，包括緩沖液、引物、探針和內(nèi)參照熒光探針。
啟動(dòng)PCR擴(kuò)增儀，設(shè)定循環(huán)參數(shù)，包括預(yù)變性、變性、復(fù)性、延伸和熒光檢測(cè)條件。
在每個(gè)循環(huán)中，加入相應(yīng)的預(yù)變性液、復(fù)性液、延伸液和檢測(cè)液，并維持一定的時(shí)間。
每次循環(huán)結(jié)束后，PCR儀自動(dòng)收集信號(hào)并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
經(jīng)過(guò)多次循環(huán)后，PCR儀將自動(dòng)停止運(yùn)行并輸出結(jié)果。
二、維護(hù)保養(yǎng)
儀器外表應(yīng)定期用軟布加少數(shù)清水擦洗，清洗后將儀器擦干。若有試劑泄漏在儀器外表，應(yīng)使用軟布加70%酒精擦洗潔凈。
反應(yīng)孔應(yīng)定期清潔，一般3個(gè)月一次，可用吹氣球輕輕吹拭。為了防止塵土進(jìn)入反應(yīng)孔，儀器不使用時(shí)，應(yīng)關(guān)閉滑蓋。若有試劑進(jìn)入樣本孔內(nèi)，應(yīng)使用無(wú)塵軟布加70%酒精擦洗潔凈。
不要頻頻開(kāi)關(guān)儀器，兩次開(kāi)關(guān)間隔時(shí)間不得低于30秒。試驗(yàn)結(jié)束后不要當(dāng)即關(guān)閉電源，應(yīng)待機(jī)10分鐘后再關(guān)閉電源。
應(yīng)使用原廠(chǎng)商供應(yīng)的電源線(xiàn)和通訊線(xiàn)，禁止在儀器上進(jìn)行沸水浴或低溫保溫(如4℃)。
儀器裝有兩個(gè)10A保險(xiǎn)絲，用以保護(hù)儀器。當(dāng)保險(xiǎn)絲發(fā)生損壞后，用戶(hù)應(yīng)按說(shuō)明書(shū)中的方法替換保險(xiǎn)絲。
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