脂糖凝膠的制作及瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)技巧

瓊脂糖凝膠電泳與其他支持物電泳最主要區(qū)別是:它兼有"分子篩"和"電泳"的雙重作用。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過(guò)時(shí)會(huì)受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相比于蛋白質(zhì)太小，對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)其分子篩效應(yīng)微不足道，故瓊脂糖凝膠電泳是核酸分析常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

瓊脂糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)單、快速，通過(guò)調(diào)整其使用濃度,使得分辨率達(dá)到大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的要求,因此成為分離、鑒定、純化核酸分子的常用方法。但操作過(guò)程中仍有不少要注意的問(wèn)題。以下內(nèi)容對(duì)初涉分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)者有一定的指導(dǎo)意義。

1 凝膠制作

1.1 凝膠濃度

配制凝膠的濃度根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要而變,一般在0.8%~2.0%之間,

如果一次配制凝膠100 ml,沒(méi)用完的凝膠可以再次融化,但隨著融化次數(shù)的增加，水分丟失也越多,凝膠濃度則會(huì)越來(lái)越高,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定,補(bǔ)水辦法有兩個(gè)：一是在容器上標(biāo)記煮膠前的刻度,煮膠后補(bǔ)充相應(yīng)的水分至原刻度;二是在煮膠前稱重,煮膠后補(bǔ)充水至原重量。粗略一點(diǎn)的方法是通過(guò)多次較恒定的煮膠條件得出一個(gè)經(jīng)驗(yàn)補(bǔ)水值。以保證凝膠濃度基本維持在原濃度。

1.2 梳板的選擇

一般每個(gè)制膠模具均配有多個(gè)齒型不同的梳板,梳板的選擇主要是看上樣量的多少而定,一般來(lái)說(shuō),上樣量小時(shí)盡量選擇薄的梳板制膠,此時(shí)電泳條帶致密清晰,便于結(jié)果分析。另外,每次制膠時(shí)都要注意梳齒與底板的距離至少要1 mm,否則,拔梳板時(shí)易損壞凝膠孔底層,導(dǎo)致點(diǎn)樣后樣品滲漏。當(dāng)然,點(diǎn)樣孔的破壞還與拔梳板的時(shí)間和方法有關(guān),一般凝膠需冷卻30 min以上方可拔梳板,拔梳板的方法是將制膠槽放置在電泳槽中的電泳緩沖液中,然后垂直向上慢慢用力,因?yàn)橛幸后w的潤(rùn)滑作用,梳板易拔出且不易損壞點(diǎn)樣孔。

2 點(diǎn)樣

在樣品中加入上樣緩沖液，上樣緩沖液中含有甘油或蔗糖以增加密度，使樣品沉入孔底；上樣緩沖液中一般還含有兩種指示劑，溴酚蘭和二甲苯青，用于指示樣品的遷移過(guò)程。上樣緩沖液儲(chǔ)存液一般為6×(10×)，表示其濃度為工作濃度的六倍。使用時(shí)上樣緩沖液應(yīng)稀釋到一倍濃度。點(diǎn)樣方法是將移液器基本垂直對(duì)準(zhǔn)點(diǎn)樣孔，用另一只手幫助固定移液器下端，移液器槍頭進(jìn)入點(diǎn)樣孔即可將樣品注入孔內(nèi)，千萬(wàn)不可將插至孔底。同時(shí)DNA分子上樣大小應(yīng)基本在分子量標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)。

3 電泳

將電泳儀的正極與電泳槽的正極相連，負(fù)極與負(fù)極相連。核酸帶負(fù)電荷，從負(fù)極向正極移動(dòng)。電泳槽中電泳緩沖液與制膠用電泳緩沖液應(yīng)相同，電泳緩沖液剛好沒(méi)過(guò)凝膠1mm為好，電泳緩沖液太多則電流加大，凝膠發(fā)熱。電泳時(shí)所加電壓一般不超過(guò)5v/cm(指的是正負(fù)電極之間的距離，而不是凝膠的長(zhǎng)度)，電泳時(shí)間一般為30～60 min，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要也可作適當(dāng)調(diào)整。電壓增高，電泳時(shí)間縮短，核酸條帶相對(duì)來(lái)說(shuō)不夠整齊，不夠清晰；相反，電壓降低，電泳時(shí)間較長(zhǎng)，核酸條帶整齊清晰。 另外，如果電泳后樣品泳動(dòng)很慢或者沒(méi)泳動(dòng)，請(qǐng)檢查膠模兩端的封口膠條是否已去掉。

4 結(jié)果分析

較成功的電泳結(jié)果是分子量標(biāo)準(zhǔn)條帶和樣品條帶整齊清晰,如果條帶模糊暗淡,單從瓊脂糖凝膠電泳角度來(lái)說(shuō),可能的原因:溴化乙錠的質(zhì)和量怎樣?溴化乙錠見光易分解,母液配制時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或保存不當(dāng);電泳槽中緩沖液使用次數(shù)過(guò)多,緩沖能力下降。特別是TAE緩沖液,一般用2~3次就要更換,TBE緩沖液則可使用10次左右。溴化乙錠(EB)是一種中等強(qiáng)度誘變劑,操作過(guò)程中要戴手套,并將加有EB的染色液作好標(biāo)記、妥善保存。除了EB外，也可以使用Golden View，10000xSybr green I，AidGreen(GelGreen)核酸染料等進(jìn)行替代。