干貨分享丨HPLC檢測出了奇怪的峰型，怎么辦？

高效液相色譜及高效液相的分離原理是什么呢？

  高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC，又稱為“高壓液相色譜和高分離度液相色譜等”）是一項重要的分析分離技術，用于分離和鑒定混合物中的多種組分，并對各種組分進行定量分析。 HPLC采用高壓輸送系統(tǒng)，將含有樣品溶液的不同極性的（單一或不同比例混合）溶劑和流動相泵入填充有固定吸附材料的色譜柱中。樣品中不同組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在色譜柱中做相對運動時，經(jīng)過反復多次的吸附-解吸的分配過程，使不同組分在移動速度上產(chǎn)生較大差別，從而實現(xiàn)分離。

為什么色譜峰會出現(xiàn)拖尾？

1. 樣品溶劑極性過強——解決辦法：確保樣品溶劑極性低于或者等同于流動相極性；

2. 色譜柱超載——解決辦法：減少進樣體積或減小進樣濃度；

3. 篩板堵塞或柱失效——解決辦法：反向沖洗色譜柱，替換篩板或更換色譜柱；

4. 存在干擾峰——解決辦法：使用更長的色譜柱，或更換流動相，或更換選擇性更好的色譜柱；

5. 色譜柱塌陷、污染等色譜柱本身的問題——解決辦法：更換色譜柱。

為什么色譜峰出現(xiàn)雙峰或分叉？

色譜雙峰指的是一種物質(zhì)在一張色譜圖中出現(xiàn)兩個峰。這種情況可能由于：

1. 溶劑極性及進樣量——解決辦法：當溶劑的極性與流動相的極性相差非常大也可能出現(xiàn)雙峰，將進樣量減少一半以上；當進樣量不大，但是濃度很大時，則考慮是色譜柱過載，將樣品稀釋后再進樣；

2. 樣品體積過大——解決辦法：用流動相配樣，總的樣品體積小于第一峰的15%；

3. 流動相比例不合適——解決辦法：調(diào)節(jié)有機相比例；

4. 樣品溶劑極性過強——解決辦法：采用較弱的樣品溶劑；

5. 樣品的特性——解決辦法：動態(tài)平衡的互變異構現(xiàn)象，如紅霉素；

6. 色譜柱——解決辦法：原色譜峰出現(xiàn)雙峰且一大一小，可以判斷色譜柱柱頭受堵，將色譜柱反過來接，用流動相沖洗或用酸洗或其他試劑；

7. 柱塌陷或形成短路通道——解決辦法：更換色譜柱，采用較弱腐蝕性條件；

8. 柱內(nèi)燒結不銹鋼失效——解決辦法：更換燒結不銹鋼，加在線過濾器，過濾樣品。

為什么色譜圖中出現(xiàn)“鬼峰”？

當色譜圖上出現(xiàn)比較雜亂且詭異的峰時我們稱它為“鬼峰”。這種情況可能由于：

1. 上次進樣的殘留——解決辦法：用強溶劑沖洗色譜柱，并用初始流動相平衡色譜柱30 min及以上；

2. 溶劑中有氣泡——解決辦法：溶劑脫氣；

3. 樣本中存在不明干擾物——解決辦法：樣本凈化或預分離；

4. 色譜柱未平衡——解決辦法：重新平衡色譜柱，用流動相作樣品溶劑（尤其是離子對色譜）；

5. （TFA）氧化——解決辦法：每天新配，用抗氧化劑；

6. 溶劑污染——解決辦法：使用新配制的HPLC級溶劑，梯度方法常表現(xiàn)為“鬼峰”。

為什么色譜峰峰型展寬，變成“矮胖型”？

色譜圖在正常的情況下是“瘦高型”的，變成“矮胖型”是色譜峰峰型展寬導致。這種情況可能由于：

1. 柱子沒有平衡好——解決辦法：用流動相重新平衡色譜柱；

2. 樣本溶劑極性過強——解決辦法：確保樣品溶劑低于或者等同于流動相的強度；

3. 進樣量過大——解決辦法：減少進樣體積，避免樣品過載；

4. 進樣濃度過大——解決辦法：減少進樣濃度，避免樣品過載；

5. 流動相比例不合適——解決辦法：調(diào)節(jié)有機相比例；

6. 溫度波動——解決辦法：使用恒溫控制的柱溫箱，溫度越高峰形越尖銳；

7. 流動相粘度太高——解決辦法：增加柱溫；

8. 保留時間長——解決辦法：用梯度洗脫或更強的流動相；更換短的色譜柱；

9. 色譜柱塌陷——解決辦法：更換新的色譜柱；

10. 檢測器時間常數(shù)慢——解決辦法：調(diào)節(jié)時間常數(shù)使之與峰寬匹配。

為什么色譜圖中出現(xiàn)倒峰？

1. 常為溶劑峰，樣本的溶劑的極性和光吸收度與流動相相差很大，而進樣量又較大的話，樣本的溶劑不能和流動相充分混合均勻，溶劑被洗脫形成一個峰，如果溶劑的紫外吸收比流動相小，就會出現(xiàn)負峰；或流動相加了有一定紫外吸收的添加劑，而樣品中含有無紫外吸收的無機鹽或其它物質(zhì)時，也會出現(xiàn)負峰——解決辦法：用流動相作為樣本溶劑，使用高純度的溶劑作為流動相；

2. 折光檢測器：溶質(zhì)折射率小于溶劑折射率——解決辦法：無誤；將極性調(diào)反使之為正；

3. 樣品中的雜質(zhì)沒有紫外處吸收或吸收很小，而流動相紫外吸收大時，如用甲醇時波長設定在220nm以下時，常出現(xiàn)這種現(xiàn)象；

4. 進樣過程中進入了空氣也會導致的。

用液相測定多種物質(zhì)時，怎樣可以使色譜圖中的色譜峰位發(fā)生重排呢？

在分析多組分樣品時，僅改變流動相的強度（組成百分比）而不改變其組成，一般僅僅改變所有組分的保留時間，不會發(fā)生峰位的重排。以下條件的改變可能發(fā)生峰位重排：

1. 流動相中換了強溶劑；

2. PH值的改變；

3. 色譜柱填料的改變；

4. 柱溫的改變；

5. 流動相的組成改變（如加入離子對試劑三乙基胺等）。