真空冷凍干燥技術(shù)在生物制品中的應(yīng)用

采用真空冷凍干燥法保存微生物(如菌種、病毒等)或生物系統(tǒng)(如血液細胞、角膜等)是目前便捷的一種方法。由于凍干藥品呈多孔狀、可長期貯存、復(fù)水性好，且可恢復(fù)活性，因此冷凍干燥技術(shù)廣泛應(yīng)用于制備固體蛋白質(zhì)藥物、口服速溶藥物及藥物包埋劑脂質(zhì)體等。從國家食品藥品監(jiān)督管理局數(shù)據(jù)庫得知，目前國內(nèi)已有注射用重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、注射用重組人干擾素α2b、凍干鼠表皮生長因子、外用凍干重組人表皮生長因子、注射用重組鏈激酶、注射用重組人白介素-2、注射用重組人生長激素、注射用A群鏈球菌、注射用重組人干擾素α2b、凍干人凝血因子VⅢ、凍干人纖維蛋白原等凍干藥品已獲準(zhǔn)上市。

目前認為凍結(jié)過程對細胞的損傷機理主要是溶質(zhì)效應(yīng)和機械效應(yīng)。當(dāng)細胞溶液的溫度降到其平衡凍結(jié)點以下一定的過冷度后，細胞外溶液首先結(jié)晶，純水的凍結(jié)使細胞間隙內(nèi)的液體逐漸濃縮，電解質(zhì)濃度顯著增強，溶液的pH、離子強度、滲透壓發(fā)生變化，導(dǎo)致細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變性以及細胞脫水死亡，即所謂的溶質(zhì)效應(yīng)。在預(yù)凍過程中，細胞內(nèi)的水分結(jié)冰，體積膨脹，細胞內(nèi)的冰晶生長對細胞膜及細胞器膜產(chǎn)生機械剪切破壞，稱為機械效應(yīng)。冷凍速率越快，胞內(nèi)冰晶形成的數(shù)量越多，機械損傷就越大。此外，凍結(jié)過程對細胞凍干效果也至關(guān)重要，如果不能提供有效的預(yù)凍條件，隨后的干燥過程也會加速細胞的損傷和死亡。生物制品的玻璃化保存是避免冰晶生長的主要措施，也是實現(xiàn)生物體低溫保存的主要途徑。如用海藻糖做保護劑實現(xiàn)了紅細胞的玻璃化保存，各項指標(biāo)均達到臨床輸注標(biāo)準(zhǔn)。

真空冷凍干燥過程對細胞損傷的兩大根源是細胞膜的融合與膜脂質(zhì)的相轉(zhuǎn)變。在正常生理條件下，細胞膜中的磷脂的極性基團通過與水分子結(jié)合而在空間上相互隔開，但細胞膜失水后，極性基團的聚合密度增大，膜上的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與脂類之間發(fā)生相互作用，以極性基團間的氫鍵結(jié)合來補償丟失水分中的氫，導(dǎo)致胞膜融合、破損，內(nèi)容物外溢。這種強烈的相互作用還導(dǎo)致相轉(zhuǎn)變溫度升高，如卵磷脂在水合時的相轉(zhuǎn)變溫度約為-7℃，而在脫水時升高至約70℃。故干脂膜在室溫下處于凝膠相，很容易發(fā)生不可逆的相分離，此外，在復(fù)水過程中，處于凝膠相的脂膜會向液晶相轉(zhuǎn)變，造成膜通透性增加，使細胞內(nèi)外物質(zhì)自由雙向交換，導(dǎo)致細胞代謝紊亂。

所以應(yīng)尋找適當(dāng)?shù)膬龈杀Ｗo劑，一方面具有較高的玻璃化溫度，在凍結(jié)過程中能降低冰晶和溶質(zhì)的損失;另一方面又能在干燥過程中代替水分子穩(wěn)定細胞膜骨架，保持其完整性。

“優(yōu)先排阻”假說同樣適用于冷凍-融化過程。蛋白質(zhì)保護劑在溶液中被從蛋白質(zhì)表面排斥，在凍結(jié)過程中能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)。但是優(yōu)先作用機理不能解釋用聚合物或蛋白質(zhì)自身在高濃度時保護蛋白質(zhì)的現(xiàn)象。

在凍干過程中，由于蛋白質(zhì)的水合層被除去，優(yōu)先作用機理不再適用。對于凍干保護機理，仍在研究探討之中，目前主要有兩種:

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn):自然界中存在的、能夠在低溫脫水狀態(tài)下存活的有機體細胞內(nèi)聚集大量的二糖，常見的為海藻糖和蔗糖，故提出“水替代”假說來解釋二糖的保護機理。

該假說認為由于蛋白質(zhì)分子中存在大量氫鍵，結(jié)合水通過氫鍵與蛋白質(zhì)分子連接。在冷凍干燥過程中，當(dāng)生物大分子失去結(jié)合水膜后，雙糖分子中的羥基能在其失水部位以氫鍵形式與之連接，及時形成一層假定的水化膜，這樣可保護氫鍵的聯(lián)結(jié)位置不直接暴露在周圍環(huán)境中，在物理狀態(tài)上保持與結(jié)合水存在時相似，從而保持了生物分子的高級結(jié)構(gòu)和功能，防止蛋白質(zhì)因凍干而變性，使其即使在低溫冷凍和干燥失水的情況下，仍保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的完整性。另外，二糖的存在還有助于降低脂質(zhì)的相轉(zhuǎn)變溫度T?。

如卵磷脂在蔗糖或海藻糖存在下，T?降低至-20°C，比水合的卵磷脂的T?低10°C，比無海藻糖干燥的卵磷脂的T?低90°C，這樣干膜脂質(zhì)在室溫下是液晶相，避免了相分離的發(fā)生，且在復(fù)水過程中也不會發(fā)生相轉(zhuǎn)變和脂質(zhì)雙分子層的泄露。

對于細胞的保護，氫鍵和玻璃化都是必需的，所以兩個假說并不互相排斥。舉個典型的例子具有較高T’g，葡萄糖能夠與膜基團直接相互作用，單獨使用時均不能阻止干態(tài)下脂質(zhì)膜的泄漏，但兩者的組合使用能有效地保護脂質(zhì)膜。所以，在血液細胞的冷凍干燥保存中宜采用二糖和高聚物組合作為凍干保護劑。

杭州富睿捷科技有限公司(FTFDS)是一家專業(yè)從事真空冷凍干燥系統(tǒng)、離心濃縮儀、微球自動化產(chǎn)品研發(fā)、生產(chǎn)、銷售及服務(wù)為一體的國1家1級高新技術(shù)企業(yè)，致力于為客戶打造定制化、專業(yè)化、品質(zhì)化的解決方案。公司聯(lián)合浙江大學(xué)專業(yè)科研組，成立高質(zhì)量的科研團隊，擁有雄厚的科研力量，為產(chǎn)品的創(chuàng)新奠定了堅實基礎(chǔ)。

公司已通過IS09001/IS014001/IS045001三大體系認證，目前獲得國家知識產(chǎn)權(quán)局頒發(fā)的軟件著作權(quán)和實用新型專1利30余件，多個產(chǎn)品通過省級以上第三方計量機構(gòu)檢測并獲得報告證書。

富睿捷始終秉承“勤懇誠信、惠人達己”的企業(yè)文化和“技術(shù)創(chuàng)新、永無止境”發(fā)展理念，以“專業(yè)是基礎(chǔ)、服務(wù)是保證、質(zhì)量是信譽”為企業(yè)生存宗旨，不斷研發(fā)新產(chǎn)品、拓展新市場、樹立新理念、持續(xù)提升品牌核心競爭力。公司產(chǎn)品主要是實驗型及研發(fā)型冷凍干燥系統(tǒng)及其配套解決方案，憑借專業(yè)的研發(fā)團隊、強大的生產(chǎn)能力和優(yōu)質(zhì)的售后服務(wù)，用戶群涵蓋了生物材料、生物醫(yī)藥、環(huán)境、食品、大健康等諸多行業(yè)，讓富睿捷在市場上贏得了較高的聲譽。