干貨 | 基因編輯探秘系列之產(chǎn)品選購指南

自2012年亮相以來，CRISPR技術(shù)已在基因功能研究、藥物靶點篩選、遺傳疾病治療、癌癥研究以及作物育種等多個領(lǐng)域取得突破性成果。其工作機制如下：

Cas蛋白（例如廣泛使用的Cas9）在向?qū)NA（gRNA）的引導(dǎo)下能夠精準(zhǔn)地定位到特定的DNA序列上。一旦到達目標(biāo)位置，Cas9會與DNA結(jié)合并切割其雙鏈，從而產(chǎn)生一個雙鏈斷裂（DSB）。面對這樣的損傷，細胞會激活自身的修復(fù)機制來應(yīng)對，主要包括非同源末端連接（NHEJ）或同源重組修復(fù)（HDR）兩種方式。利用這些天然存在的DNA修復(fù)過程，科學(xué)家可以在目標(biāo)DNA位點引入所需的特定序列變化，實現(xiàn)對基因組的精確編輯。

目前CRISPR技術(shù)能的精確度對DNA進行修改，包括添加、刪除或替換特定基因片段，這一進步不僅使基因修復(fù)更加便捷和精準(zhǔn)，也為基因治療、生物育種、合成生物學(xué)等指明了新的發(fā)展方向。

針對上述基因編輯技術(shù)流程，翌圣生物可提供高品質(zhì)Cas蛋白等相關(guān)產(chǎn)品，以及蛋白改造、GMP規(guī)?；a(chǎn)定制服務(wù)。這些產(chǎn)品覆蓋了從設(shè)計到實施的整個過程，旨在幫助研究人員更高效、更準(zhǔn)確地完成基因編輯實驗。接下來，小編將選取部分重點產(chǎn)品給大家進行展示。

圖1. 不同時間的sgRNA的合成量

• 適用范圍廣：不同種類的sgRNA均可獲得高產(chǎn)量

圖2. 不同序列的sgRNA的合成產(chǎn)量

圖3. 合成的sgRNA的純度（安捷倫2100測定）

圖4. sgRNA的剪切效率效果圖

Cas9 Nuclease來源于野生型釀膿鏈球菌S. pyogenes，是依賴RNA介導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶，可以特異地切割雙鏈DNA（在DNA PAM存在的情況下，也可以切割單鏈DNA或單鏈RNA）。Cas9切割位點位于目標(biāo)序列（target sequence）內(nèi)，離PAM（NGG）區(qū)3個堿基。本產(chǎn)品經(jīng)過密碼子優(yōu)化及核定位信號（NLS）設(shè)計，由大腸桿菌重組表達而來，編輯效率高，可用于細胞（造血干細胞、T細胞等）的基因修飾，也可用于分子診斷，檢測病原體等。

A：體外切割測試：3批次體外切割活性均達98%以上。

B：體內(nèi)基因敲除，敲除效率與進口品牌一致。

圖5. Cas9 Nuclease體外切割活性及基因敲除效率結(jié)果

NLS-Cas9-EGFP在Cas9核酸酶的基礎(chǔ)上進行改造，它在N端包含一個核定位信號NLS，在C端包含一個EGFP和一個6X (His)序列，Cas9 RNP復(fù)合物在進入細胞后可立即定位到細胞核。此外，與其他系統(tǒng)相比，EGFP標(biāo)簽可作為追蹤或分類轉(zhuǎn)染細胞的報告器，通過熒光激活細胞分選(FACS)富集所需基因組編輯的細胞群。它大大降低了在基因組編輯應(yīng)用中與單細胞克隆和基因分型相關(guān)的人工和成本。

A：細胞轉(zhuǎn)染實驗：電穿孔后12 h，在熒光顯微鏡下觀察細胞。

B：切割效率檢測：線性化質(zhì)粒的消化效率大于90%。

注：20 μL的反應(yīng)體系，在含有線性化質(zhì)粒、gRNA 和Cas9的1×Cas9核酸酶反應(yīng)緩沖液中在37°C下反應(yīng)1小時，在瓊脂糖凝膠電泳測定結(jié)果顯示，線性化質(zhì)粒的消化效率大于90%。

圖6. NLS-Cas9-EGFP Nuclease細胞轉(zhuǎn)染及體外切割結(jié)果

ArCas12a核酸內(nèi)切酶，源自Agathobacter rectalis細菌的CRISPR系統(tǒng)，別名Cpf1，是一個包含1263個氨基酸的單體蛋白。Cas12a缺乏HNH結(jié)構(gòu)域，可單獨利用其RuvC結(jié)構(gòu)域在CRISPR RNA（crRNA）引導(dǎo)下識別位于靶標(biāo)核酸5’端富含胸腺嘧啶（T）的PAM區(qū)而啟動對靶標(biāo)DNA的切割，已成功用于許多哺乳動物和植物的基因組編輯。此外Cas12a還具有反式切割活性，可不加選擇地切割反應(yīng)體系中的非靶標(biāo)單鏈DNA。與LbCas12a/AsCas12a相比，ArCas12a具有更高的溫度適應(yīng)性（25-55℃），可適用于基因組編輯及核酸檢測等。

• 雙鏈DNA高效體外切割

圖7. ArCas12a順式切割活性檢測 M：Marker；C：模板雙鏈DNA。

注：在crRNA的引導(dǎo)下可高效的切割雙鏈DNA（600 bp）產(chǎn)生兩段切割產(chǎn)物（200 bp+400 bp）

圖8. ArCas12a反式切割活性檢測

注：以雙鏈DNA模板為靶標(biāo)，加入ArCas12a、crRNA（存在與模板DNA序列互補的spacer區(qū)）及單鏈DNA報告探針（含有熒光報告基團）進行體外切割，當(dāng)ArCas12a與crRNA及靶標(biāo)DNA形成復(fù)合體后會激活反式切割活性，切割單鏈DNA報告探針，從而發(fā)出熒光。結(jié)果顯示，翌圣ArCas12a與crRNA及模板DNA形成復(fù)合體后具有反式切割活性，可剪切單鏈DNA。

AapCas12b核酸酶（又名C2c1）是由tracrRNA:crRNA（或sgRNA）介導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶，來源于嗜酸耐熱菌Alicyclobacillus acidophilus，在靶標(biāo)雙鏈DNA存在PAM（TTN）序列的情況下，特異地剪切靶標(biāo)雙鏈DNA，使DNA雙鏈斷裂并生成粘性末端。AapCas12b可不依賴PAM序列特異地剪切單鏈DNA靶標(biāo)。雙鏈或單鏈DNA靶標(biāo)均能激活A(yù)apCas12b的反式剪切活性（即旁路剪切活性/附屬剪切活性），即當(dāng)AapCas12b酶與sgRNA、靶標(biāo)DNA結(jié)合形成三元復(fù)合物后，便會被激活針對非特異序列ssDNA的反式剪切活性，將體系中的任意序列ssDNA切碎。AapCas12b最佳剪切反應(yīng)溫度為60℃，比AacCas12b更耐高溫，適用于與LAMP聯(lián)用，開發(fā)恒溫擴增/CRISPR-Cas檢測體系。

• 順勢切割活性：效果媲美進口品牌T*

圖9. AapCas12b Nuclease (10 μM) (Cat#14808ES)順式切割活性驗證

注：在20 μL的反應(yīng)體系，含有帶PMA序列的雙鏈Target DNA、sgRNA、Cas12b和1×reaction buffer，在60°C下反應(yīng)30 min，85°C下滅活5 min，在瓊脂糖凝膠電泳測定結(jié)果顯示，三批次AapCas12b Nuclease (10 μM) (Cat#14808ES)均能有效切割雙鏈Target DNA,切割效果與進口品牌T*相當(dāng)。

圖10. AapCas12b Nuclease (10 μM) (Cat#14808ES)反式切割活性驗證

注：在20 μL的反應(yīng)體系，含有帶PMA序列的雙鏈Target DNA、sgRNA、Cas12b、Report ssDNA熒光探針和1×reaction buffer，在60℃反應(yīng)1h，每30 sec采集一次熒光信號，結(jié)果顯示在Target DNA、sgRNA、Cas12b共同存在的情況下，Report ssDNA熒光探針能被切割，從而釋放熒光信號。

當(dāng)前，CRISPR基因編輯技術(shù)正處于快速發(fā)展的時期，整個領(lǐng)域仍在不斷成熟和完善中。隨著科學(xué)研究和技術(shù)應(yīng)用的持續(xù)推進，我們有理由相信未來將涌現(xiàn)出更多創(chuàng)新性的基因編輯工具，這些新工具將進一步拓寬該技術(shù)的應(yīng)用場景與潛力。

如果您對基因編輯有任何需求或興趣，歡迎隨時聯(lián)系我們。無論是在基礎(chǔ)研究、藥物開發(fā)、農(nóng)業(yè)生物技術(shù)、合成生物學(xué)等領(lǐng)域，我們都致力于為您提供的技術(shù)支持和服務(wù)，共同探索基因編輯帶來的無限可能。