雙抗體夾心法檢測抗原的操作步驟及靈敏度提高方法

雙抗體夾心法檢測抗原的操作步驟：

1、包被抗體：將特異性抗體（捕獲抗體）包被在固相載體（如酶標板）表面，通常在 4℃ 過夜，使抗體通過物理吸附固定在固相表面。

2、封閉：用封閉液（如 1% - 5% 的牛血清白蛋白溶液）封閉固相載體表面未被抗體占據的位點，以減少后續(xù)檢測中的非特異性結合。在 37℃ 孵育 1 - 2 小時。

3、加樣：將待測樣品加入到已包被和封閉好的固相載體孔中，在 37℃ 孵育一定時間，使樣品中的抗原與固相載體上的捕獲抗體結合。

4、洗滌：用洗滌液洗去未結合的物質，重復多次以確保洗干凈。

5、加檢測抗體（酶標抗體）：加入酶標記的特異性抗體（檢測抗體），該抗體能識別結合在捕獲抗體上的抗原的另一個表位。在 37℃ 孵育一定時間，使檢測抗體與抗原結合，形成“捕獲抗體 - 抗原 - 酶標檢測抗體”復合物。

6、洗滌：再次用洗滌液洗去未結合的酶標檢測抗體。

7、顯色：加入酶的底物溶液，孵育一段時間，酶催化底物產生顯色反應。

8、終止反應：加入終止液終止顯色反應。

9、結果測定：使用酶標儀在特定波長下測定各孔的吸光度值。根據標準曲線計算出樣品中抗原的含量。

需要注意的是，實際操作中應根據具體的試劑盒說明書進行優(yōu)化和調整。

提高雙抗體夾心法的檢測靈敏度方法：

1、優(yōu)化抗體：選擇親和力高、特異性強的優(yōu)質抗體，以增強對抗原的結合能力。

2、增加抗體的包被量：在固相載體上包被更多的捕獲抗體，有助于捕獲更多的抗原。

3、改進包被條件：如優(yōu)化包被緩沖液的 pH 值、離子強度等，以提高抗體與固相載體的結合效率和穩(wěn)定性。

4、延長孵育時間：使抗原與抗體有更充分的結合機會。

5、提高酶的標記效率：使用更高效的標記方法或選擇活性更高的酶標記檢測抗體，以增強顯色信號。

6、優(yōu)化顯色系統(tǒng)：選擇更靈敏的顯色底物，或者改進顯色條件（如溫度、時間等）。

7、樣本前處理：對樣本進行適當的濃縮、純化等前處理步驟，以提高抗原的濃度。

8、降低檢測背景：通過更嚴格的洗滌步驟，減少非特異性結合導致的背景信號。

9、采用信號放大技術：例如使用生物素 - 親和素系統(tǒng)等方法來放大檢測信號。