想做好血液RNA-seq實驗？這些經(jīng)驗請收好！

血液是一種信息量巨大、獲取方便且微創(chuàng)的樣本類型，廣泛用于診斷和臨床研究，以探索疾病的病理和生理機制以及療法的作用。全血轉(zhuǎn)錄組測序是一種基于RNA測序（RNA-Seq）的方法，可對全血進行深入的基因表達譜分析，深入了解全系統(tǒng)范圍內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄本的表達和豐度。高通量RNA-Seq技術(shù)的發(fā)展使我們能夠以較低的成本收集高質(zhì)量的血液轉(zhuǎn)錄組信息，為發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物、了解藥物反應(yīng)、病理和生理過程以及疾病的無創(chuàng)診斷帶來了革命性的變化。

外周血的優(yōu)勢在于采集快捷，且可在大規(guī)模人群中實現(xiàn)。然而，一旦血液離開人體，問題就來了。傳統(tǒng)方法需要從全血中分離白細(xì)胞，再提取RNA，以解決血液中污染物的問題。如今，專門為制備血液樣本而開發(fā)的方案使我們能夠從全血中獲得高質(zhì)量的RNA-Seq 數(shù)據(jù)。

什么是RNA-seq？ 

RNA-seq即轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（Transcriptome sequencing），廣義的定義為：對細(xì)胞內(nèi)所有RNA（包括rRNA/ tRNA/ mRNA等）進行高通量測序，狹義的定義為：對細(xì)胞內(nèi)mRNA進行高通量測序，臨床檢驗實驗室指的一般為狹義的轉(zhuǎn)錄組測序。

血液樣本

任何血液轉(zhuǎn)錄組分析實驗的第一步都是通過靜脈穿刺或指針采血。從少量血液中獲取優(yōu)質(zhì)RNA的技術(shù)進步，如通過指針采樣，將使廣泛的研究成為可能，參與者甚至可以進行自我采樣。

血液RNA降解可能發(fā)生在采集、儲存和處理過程中，因此，血液排出體外后，必須防止或減少RNA降解。而血液RNA極易降解的原因之一是血漿中含有高濃度的RNA酶（RNase）。在一項研究中，血漿內(nèi)的游離RNA僅在15 秒鐘就發(fā)生降解，導(dǎo)致無法進行實時PCR擴增，RNA酶的威力由此可見一斑。因此，在采集全血時立即抑制RNA酶的活性至關(guān)重要，這樣才能確保采集高質(zhì)量的RNA，這對下游測序、生物標(biāo)記物鑒定和疾病診斷至關(guān)重要。

為了降低RNA的降解，特別是在開展大規(guī)模血液轉(zhuǎn)錄組學(xué)項目時，我們建議使用專門RNA采血管收集血液，如PAXgene™全血RNA 采血管（BD, 762165）。該采血管含有能穩(wěn)定 RNA 的專有試劑，能產(chǎn)生準(zhǔn)確反映采樣時血液狀態(tài)的基因表達數(shù)據(jù)。

更重要的一點，采血管的樣本儲藏時間及RNA質(zhì)量的穩(wěn)定性，是大型多中心臨床研究的一個關(guān)鍵考慮因素。PAXgene全血RNA保存管（762165）內(nèi)含能夠穩(wěn)定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄性狀的抗凝劑。抗凝劑能夠減少RNA在體外的降解，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的RNA，并將基因誘導(dǎo)的水平降低到最小程度，被廣泛用于血液RNA樣本的保存。相關(guān)實驗證明，PAXgene™ 全血RNA 采血管中樣本在-80℃儲存7年后 ，提取的RNA 質(zhì)量與產(chǎn)量均較穩(wěn)定，樣本在-20℃中儲存11年后，RNA 質(zhì)量與采集當(dāng)天相比沒有降低。

另外，如下圖所示，在沒有珠蛋白耗竭的情況下，基因檢測率會降低。從血液中分離的RNA樣本中去除rRNA及珠蛋白mRNA，可釋放出更多寶貴的測序空間，并將測序讀數(shù)集中到最重要的部分。