小鼠背根神經(jīng)節(jié)取材及電穿孔轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化

一、引言

二、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)動物

（二）主要試劑與儀器

1. 試劑

• 含有目的基因的質(zhì)粒（自行構(gòu)建并鑒定）。

• 細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM 高糖培養(yǎng)基，添加 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素）。

• 麻醉劑。

• 電穿孔緩沖液（自行配制，含特定濃度的無機(jī)鹽和緩沖物質(zhì)）。

2. 儀器

• 精密手術(shù)器械（顯微鑷、顯微剪等）。

• 電穿孔儀（具備可調(diào)節(jié)電壓、電容和脈沖時間等參數(shù)功能）。

• 細(xì)胞培養(yǎng)箱（可精確控制溫度、CO?濃度和濕度）。

（三）小鼠背根神經(jīng)節(jié)取材

1. 麻醉小鼠

• 按照 50mg/kg 的劑量腹腔注射麻醉劑，待小鼠進(jìn)入深度麻醉狀態(tài)（通過觀察小鼠對疼痛刺激無反應(yīng)，如夾尾無掙扎等）。

2. 消毒與定位

• 將小鼠背部皮膚用 75% 酒精棉球消毒，然后將小鼠置于解剖臺上，俯臥位固定。依據(jù)小鼠的解剖結(jié)構(gòu)，確定脊柱位置，標(biāo)記出需要取材的背根神經(jīng)節(jié)節(jié)段（通常為腰段）。

3. 手術(shù)操作

• 沿標(biāo)記線用顯微剪小心剪開皮膚和肌肉組織，逐層分離，避免損傷周圍血管和神經(jīng)。在顯微鏡下，清晰地暴露脊柱，輕輕去除椎骨周圍的結(jié)締組織，用精細(xì)的顯微鑷小心分離出背根神經(jīng)節(jié)，盡量保持神經(jīng)節(jié)的完整性及其周圍神經(jīng)纖維的連接。

4. 神經(jīng)節(jié)處理

• 將取下的背根神經(jīng)節(jié)迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的細(xì)胞培養(yǎng)液中，清洗 2 - 3 次，以去除表面的血液和雜質(zhì)，然后放置在冰上備用。

（四）電穿孔轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

1. 細(xì)胞準(zhǔn)備

• 將清洗后的背根神經(jīng)節(jié)轉(zhuǎn)移至電穿孔緩沖液中，輕輕吹打，使神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分散均勻。

2. 電穿孔參數(shù)設(shè)置與分組

• 設(shè)置多組電穿孔參數(shù)實(shí)驗(yàn)，包括不同的電壓（如 100V、150V、200V 等）、電容（如 25μF、50μF、100μF 等）和脈沖時間（如 5ms、10ms、20ms 等）。將神經(jīng)節(jié)細(xì)胞與含有目的基因的質(zhì)?；旌暇鶆蚝螅謩e按照不同參數(shù)組合進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)染操作。

3. 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)

• 電穿孔轉(zhuǎn)染完成后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有完整培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng) 24 小時、48 小時和 72 小時后，分別收集細(xì)胞，采用熒光定量 PCR 和 Western blot 技術(shù)檢測目的基因的表達(dá)情況，以評估轉(zhuǎn)染效率。

三、結(jié)果

（一）取材效果評估

（二）電穿孔轉(zhuǎn)染結(jié)果

1. 不同電壓對轉(zhuǎn)染效率的影響

• 在電容和脈沖時間固定的情況下，隨著電壓的升高，轉(zhuǎn)染效率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。例如，當(dāng)電容為 50μF、脈沖時間為 10ms 時，150V 電壓下轉(zhuǎn)染效率高，目的基因的表達(dá)量較 100V 時提高了約 50%，而 200V 時由于過高的電壓導(dǎo)致細(xì)胞損傷，轉(zhuǎn)染效率下降，目的基因表達(dá)量較 150V 時降低了約 40%。

2. 不同電容對轉(zhuǎn)染效率的影響

• 在電壓和脈沖時間恒定的條件下，電容的變化也對轉(zhuǎn)染效率有顯著影響。以電壓 150V、脈沖時間 10ms 為例，50μF 電容時轉(zhuǎn)染效率佳，較 25μF 時目的基因表達(dá)量提高了約 35%，而 100μF 時由于電容過大，引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)境過度變化，轉(zhuǎn)染效率略有下降，目的基因表達(dá)量較 50μF 時降低了約 20%。

3. 不同脈沖時間對轉(zhuǎn)染效率的影響

• 當(dāng)電壓和電容固定時，脈沖時間的改變影響轉(zhuǎn)染效率。如電壓 150V、電容 50μF 時，10ms 脈沖時間下轉(zhuǎn)染效果好，目的基因表達(dá)量較 5ms 時提高了約 45%，但 20ms 脈沖時間過長，導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染效率下降，目的基因表達(dá)量較 10ms 時降低了約 30%。

四、討論