實驗干貨｜蛋白質(zhì)濃度測定之BCA法的技巧

BCA法是Lowry法的一種改進方法。與Lowery法相比，BCA法操作起來更加簡單方便，其試劑及其形成的顏色絡(luò)合物穩(wěn)定性更好，幾乎不受其他干擾物的影響，并且靈敏度高（微量檢測可達到0.5ug/ml），應(yīng)用起來更加靈活。BCA法與Bradford法相比，BCA法的顯著優(yōu)點是不受去垢劑（SDS，Triton X-100，Tween-20等）的影響。

BCA法實驗的原理

BCA是一種穩(wěn)定的堿性水溶性復(fù)合物。在堿性條件下，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA Reagent A（含有BCA）相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng)，形成紫色的絡(luò)合物。該水溶性的復(fù)合物在A562 nm處顯示強烈的吸光性，吸光度和蛋白質(zhì)濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度。

BCA實驗物資與設(shè)備

? 物資清單

1. BCA試劑盒：通常包含BCA溶液A與B，使用前需按比例混合均勻。

2. 蛋白質(zhì)標準品：一般采用牛血清白蛋白（BSA）作為標準蛋白，用于繪制標準曲線。

3. 比色皿：可選用96孔板或其他規(guī)格，用于盛放樣品并進行光度測量。

4. 離心管：用于樣品的制備與儲存。

5. 移液器及配套吸頭：用于精確量取與添加不同體積的液體。

6. 去離子水：用于配制溶液與稀釋樣品

? 設(shè)備介紹

光譜光度計：在BCA法測定蛋白質(zhì)濃度的過程中，光譜光度計是需要的儀器，它用于測量樣品在特定波長（562納米）下的吸光度。在選擇光譜光度計時，應(yīng)關(guān)注以下幾點：

 • 精確度：儀器必須能夠精確讀取至0.001吸光單位的變化。

 • 波長范圍：確保設(shè)備能夠覆蓋所需的測試波長，特別是BCA法所需的562納米。

 • 處理能力：根據(jù)實驗規(guī)模，選擇具有合適讀取速度與樣品處理能力的光度計，如單孔至多孔板光度計。

BCA實驗操作步驟

一、微孔板檢測

① BCA工作液配制。根據(jù)標準品和樣品數(shù)量，按50體積BCA 試劑A加1體積BCA 試劑 B（50:1）配制適量BCA工作液，充分混勻。

② 標準曲線繪制。取一塊酶標板（酶標板的板底是不能用手去觸碰的，一般拿的是側(cè)壁），按下表數(shù)據(jù)加入試劑：

③ 樣品準備：將待測蛋白樣品用去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，取20 ul樣品，加入200 ul BCA工作液（蛋白液：工作液=1:20）。加樣時槍要輕柔吹打，將其中液體混勻。

④ 振蕩混勻后，37℃放置20 ~ 30 min。冷卻至室溫。顏色變化如下圖：

⑤ 用酶標儀測定A562 nm處的吸光值，以不含BSA的吸光值為空白對照。

⑥ 以蛋白含量(ug)為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪出標準曲線。

⑦ 根據(jù)測得的吸光值，在標準曲線上即可計算出樣品的蛋白含量。

⑧ 計算蛋白濃度：以查得的蛋白含量除以樣品體積20 ul，再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得到待測樣品的實際濃度。

二、微孔板檢測

① BCA工作液配制。根據(jù)標準品和樣品數(shù)量，按 50 體積BCA Reagent A加1體積BCA Reagent B（50:1）配制適量BCA工作液，充分混勻。

② 選取7支潔凈試管，其中6支標號1~6號管（包含第1支空白管），另外1支標記待測管。按照下表用移液器準確移取相應(yīng)的標準蛋白溶液或待測樣品、蒸餾水和BCA工作液于試管中。

③ 取適量體積的標準蛋白（根據(jù)情況用去離子水適度稀釋），以蛋白液：工作液=1:20 的比例混勻。37 ℃ 溫浴 30 min。冷卻至室溫。

④ 然后吸取各試管中的溶液于比色皿中并用分光光度計的562nm波長比色測定吸光度值。

BCA實驗注意事項

 • 為保證蛋白濃度測量的準確性，最好做3個復(fù)孔，必要時剔除離群值。

 •  BCA法測蛋白濃度易受時間及溫度的影響，所以最好每次測定都做標準曲線。

 • 加樣時一定要準確加樣且盡可能避免氣泡產(chǎn)生，以免影響測量（加樣結(jié)束可以用注射器戳破氣泡，并將96孔板放在搖床上混勻片刻，以使樣品與工作液充分接觸）。

 • 孵育結(jié)束應(yīng)盡快檢測吸光度，并盡可能加快檢測速度，以免帶來誤差。