利用ACDLabs AutoChrom軟件及統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)行基于ICH Q14的有關(guān)物質(zhì)分析方法開(kāi)發(fā)

摘要：本文旨在介紹一種基于ICH Q14指南的有關(guān)物質(zhì)分析方法開(kāi)發(fā)流程，該方法利用ACD/AutoChrom 軟件和統(tǒng)計(jì)學(xué)工具來(lái)開(kāi)發(fā)HPLC分析方法和驗(yàn)證分析方法的耐用性范圍。通過(guò)案例研究某主成分及其雜質(zhì)的分析，展示了如何確保方法的專屬性、準(zhǔn)確度和靈敏度及確定合理的耐用性范圍。

在藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中，有關(guān)物質(zhì)的分析是確保藥品質(zhì)量的關(guān)鍵步驟。ICH Q14指南提供了一個(gè)關(guān)于方法開(kāi)發(fā)的框架，要求分析方法必須滿足專屬性、準(zhǔn)確度和靈敏度等要求。本文通過(guò)某主成分的案例，詳細(xì)描述了按照ICH Q14要求如何利用ACD / AutoChrom 軟件和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來(lái)開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證HPLC分析方法。

開(kāi)發(fā)范圍：包括Imp. 1、Imp. 2、Imp. 3、Imp. 4、Imp. 5、Imp. 6等已知雜質(zhì)以及未知雜質(zhì)和總雜質(zhì)。

• PH的確定：利用ACD/Labs軟件預(yù)測(cè)該主成分及各雜質(zhì)的log D

各組份在pH 0-11范圍內(nèi)log D均大于1，無(wú)保留的風(fēng)險(xiǎn)，且不受pH影響，考慮到大多數(shù)色譜柱的pH耐用性，pH確定為2.0~8.0范圍。

• 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定：使用DAD，獲得各組份的DAD數(shù)據(jù)，如下圖。

通過(guò)DAD圖進(jìn)行對(duì)比，選擇230nm波長(zhǎng)作為該分析方法的檢測(cè)波長(zhǎng)。

篩選獲得的方法中發(fā)現(xiàn)有一個(gè)未知工藝雜質(zhì)與不同已知雜質(zhì)有較多的分離問(wèn)題，是本方法的主要的專屬性方面的風(fēng)險(xiǎn)。

洗脫梯度 1：

洗脫梯度 2：

根據(jù)以上條件得到的圖譜，使用 AutoChrom 軟件進(jìn)行建模，模型如下：

表一：梯度表（柱溫40℃）

2、使用中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)條件在相同品牌不同設(shè)備編號(hào)的儀器上進(jìn)行重現(xiàn)，圖譜如下：

不同設(shè)備編號(hào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表：

解析：儀器2與儀器3實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Imp.3與未知雜質(zhì)實(shí)際分離度和軟件模擬結(jié)果重現(xiàn)度高，而儀器1相對(duì)另外兩臺(tái)儀器，主峰保留時(shí)間提前了近兩分鐘，同時(shí)Imp.3與未知雜質(zhì)分離最差。其原因可能與泵和管路的差異有關(guān)。

洗脫梯度 1：

洗脫梯度 2：

根據(jù)以上條件得到的圖譜進(jìn)行建模，模型如下：

表二：梯度表（柱溫35℃）

4、使用中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)條件在相同品牌不同設(shè)備編號(hào)的儀器上進(jìn)行重現(xiàn)

儀器1上中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)加雜溶液（主成分：1mg/ml，各雜質(zhì)：1μg/ml）圖譜如下：

解析：經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Imp.3 與未知雜質(zhì)實(shí)際分離度為：5.7，和軟件模擬重現(xiàn)度好，結(jié)合原模型獲得的空間，調(diào)整中心點(diǎn)，確定使用該梯度條件及柱溫為 35℃。

下表展示了選取的變化因素及高低水平的設(shè)置，在AutoChrom 軟件中預(yù)測(cè)出如下條件變化產(chǎn)生243個(gè)實(shí)驗(yàn)組合的最小分離度。

利用JMP對(duì)方法參數(shù)的范圍和相互作用進(jìn)行探索，將AutoChrom 軟件中模擬出243個(gè)實(shí)驗(yàn)的最小分離度導(dǎo)入統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（JMP），進(jìn)行處理得到如下結(jié)果：

解析：由預(yù)測(cè)值-實(shí)際值圖可以得出，本數(shù)據(jù)模型RSq值為0.95，模型準(zhǔn)確度較高，故AutoChrom 軟件模擬預(yù)測(cè)出的243個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有參考意義，上表設(shè)定的條件范圍為耐用性空間范圍；由預(yù)測(cè)刻畫(huà)器圖可以看出，有機(jī)相起始比例、有機(jī)相終止比例、柱溫和流速對(duì)于分離度有影響，其中柱溫的影響是顯著的，由模型數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果可以初步確定本方法在柱溫35℃，流速為1.2ml/min，洗脫梯度為如下表格。

在此數(shù)據(jù)模型下，探索統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（JMP）對(duì)于方法開(kāi)發(fā)階段的幫助，在預(yù)測(cè)刻畫(huà)器中，使用設(shè)計(jì)空間刻畫(huà)器，設(shè)置我們所需要達(dá)到的低分離度，可以得到我們滿足分離要求的空間，由于本方法模型數(shù)據(jù)均符合分離要求，在此設(shè)計(jì)一個(gè)較大的分離度要求（分離度≥2.5）

解析：在內(nèi)移至所有條件均滿足分離度要求（分離度≥2.5）時(shí)，此時(shí)的方法為耐用性范圍為：有機(jī)相起始比例（28±1%）、有機(jī)相終止比例（32±1%）、梯度洗脫時(shí)間（25±1min）、柱溫（30~37℃）及流速（1.2±0.1ml/min）；在此基礎(chǔ)上將限值發(fā)送到模擬器對(duì)耐用性范圍進(jìn)行驗(yàn)證。

解析：由模擬器模擬后得到，耐用性范圍與設(shè)計(jì)空間刻畫(huà)器一致。

從實(shí)際出發(fā)，以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)來(lái)論證本方法耐用性空間，在對(duì)分離影響較大的各個(gè)因素中取邊界點(diǎn)，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)出12針處于耐用性空間邊界的12個(gè)色譜條件，如下表格：

并且在儀器1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下：

為了進(jìn)一步確保此方法在不同品牌儀器間差異，再?gòu)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)軟件設(shè)計(jì)的12個(gè)色譜條件中選擇序號(hào)1、2、3、7、9和10色譜條件（每個(gè)因素的高低水平都各有三個(gè)實(shí)驗(yàn)條件，相當(dāng)于也是均勻分布在耐用空間上的6個(gè)點(diǎn)），在不同品牌儀器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，圖譜如下：

耐用性范圍為：有機(jī)相起始比例（28±1%）、有機(jī)相終止比例（32±1%）、梯度洗脫時(shí)間（25±1min）、柱溫（35±5℃）及流速（1.2±0.1ml/min）。

本研究成功開(kāi)發(fā)了一種基于ICH Q14的HPLC分析方法，用于某主成分及其雜質(zhì)的檢測(cè)。利用ACD/ AutoChrom 軟件和統(tǒng)計(jì)學(xué)工具，優(yōu)化了色譜條件，確保了方法的專屬性、準(zhǔn)確度和靈敏度，并建立了方法的耐用性空間。

Comments

分析方法抗微擾的能力是其自身質(zhì)量的重要的屬性，抗干擾能力越強(qiáng)，在方法的轉(zhuǎn)移和使用時(shí)自身出問(wèn)題的可能性越低。Q14 期望分析方法開(kāi)發(fā)能夠同時(shí)考慮多因素的綜合影響，同和藥業(yè)的此項(xiàng)工作在中國(guó)的化學(xué)制藥領(lǐng)域創(chuàng)造了第一。