溫和且靈活地自動(dòng)化培養(yǎng)哺乳動(dòng)物貼壁細(xì)胞

實(shí)現(xiàn)本應(yīng)用自動(dòng)化的三大理由

哺乳動(dòng)物體外細(xì)胞培養(yǎng)物的可用性是藥物發(fā)現(xiàn)的一個(gè)關(guān)鍵瓶頸。為了將哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為基于細(xì)胞的高通量測(cè)試的資源，必須克服人工細(xì)胞繁殖缺乏標(biāo)準(zhǔn)化、重復(fù)性差和通量不足的問(wèn)題。

• 提供大量培養(yǎng)細(xì)胞。

• 確?？芍貜?fù)性和過(guò)程安全性。

• 標(biāo)準(zhǔn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞增殖。

簡(jiǎn)介

在藥物篩選和細(xì)胞生物學(xué)研究中對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的需求不斷增加。在高通量篩選中，候選藥物的評(píng)估基于其對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的生物效應(yīng)，在基于細(xì)胞的ADME-T測(cè)定中測(cè)試新化合物的代謝行為和毒性?；A(chǔ)研究依賴(lài)于大量的細(xì)胞系和原代細(xì)胞，它們構(gòu)成了闡明細(xì)胞增殖、分化和功能的基本機(jī)制的工具。在這個(gè)領(lǐng)域，胚胎干細(xì)胞作為一個(gè)模型系統(tǒng)越來(lái)越重要。這些細(xì)胞除了具有巨大的分化潛能外，還具有無(wú)限自我更新的能力，這有助于它們進(jìn)行有效的基因修飾。目前使用的細(xì)胞培養(yǎng)方法的局限性包括缺乏標(biāo)準(zhǔn)化與重復(fù)性差和通量不足。由此可見(jiàn)，細(xì)胞的可用性會(huì)成為實(shí)驗(yàn)全流程的瓶頸。HAMILTON和Life&Brain結(jié)合了他們?cè)谠?xì)胞、細(xì)胞系和胚胎干細(xì)胞自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)開(kāi)發(fā)方面的專(zhuān)業(yè)知識(shí)，該系統(tǒng)可大量提供高質(zhì)量的細(xì)胞。

方法描述

該系統(tǒng)的典型流程包括：

• 預(yù)定運(yùn)行期間細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)基的更換

• 胰蛋白酶化后細(xì)胞培養(yǎng)物的收集

• 在培養(yǎng)孔內(nèi)均勻地接種細(xì)胞

• 向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加生長(zhǎng)因子或藥理活性物質(zhì)

通常培養(yǎng)基更換在隔夜運(yùn)行中進(jìn)行，如下所示：

• 通過(guò)工作列表選擇感興趣的微孔板

• 計(jì)算容器中的適量培養(yǎng)基，并從冷培養(yǎng)箱中獲取；然后將培養(yǎng)基容器轉(zhuǎn)移至加熱位置

• 將第一個(gè)板從溫培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移到移液工作站，并去除殘留的培養(yǎng)基

• 使用一次性吸頭或可洗鋼針更換培養(yǎng)基

• 將微孔板轉(zhuǎn)移回培養(yǎng)箱中

手動(dòng)溫和處理 - 轉(zhuǎn)移至自動(dòng)化流程

Hamilton的液體處理技術(shù)可以模擬典型的手動(dòng)操作，例如板混勻或溫和移液。本品非常適合處理脆弱的哺乳動(dòng)物貼壁細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞。

技術(shù)

Hamilton“無(wú)管” 技術(shù): Hamilton 監(jiān)測(cè)空氣置換（MAD）移液技術(shù)消除了管、泵或系統(tǒng)液體的使用，從而顯著降低了細(xì)菌生長(zhǎng)造成污染的風(fēng)險(xiǎn)。

接種

這采用Cellhost系統(tǒng)接種可使小鼠胚胎干細(xì)胞均勻分布在飼養(yǎng)細(xì)胞層上。在胚胎干細(xì)胞的情況下，細(xì)胞的均勻分布尤為重要，因?yàn)榧?xì)胞團(tuán)塊的形成導(dǎo)致不受控制的分化。為了達(dá)到這一結(jié)果，用機(jī)械手模擬在微孔板上分配細(xì)胞的典型手動(dòng)動(dòng)作。套系統(tǒng)主要由8通道的Microlab   STARlet液體處理工作站構(gòu)成，手動(dòng)裝載吸頭、試劑、濾膜板和PCR板的載架，真空抽濾系統(tǒng)整合在工作站的臺(tái)面上。在操作過(guò)程中，通過(guò)CO-RE抓手來(lái)移動(dòng)微孔板、裝載及拆卸抽濾板架。

培養(yǎng)基更換

細(xì)胞培養(yǎng)中最常見(jiàn)的流程是培養(yǎng)基的更換。為了最大限度地減少殘留量，在一側(cè)升高細(xì)胞培養(yǎng)板（圖2），并在孔的底端小心吸出培養(yǎng)基。在孔邊緣緩慢加入新培養(yǎng)基，從而避免干擾細(xì)胞層。顯微鏡研究顯示細(xì)胞層的完整性（圖3a）-與不太謹(jǐn)慎的手動(dòng)實(shí)驗(yàn)形成鮮明對(duì)比（圖3b）。

系統(tǒng)描述

Cellhost系統(tǒng)的核心是配備內(nèi)部機(jī)械手iSWAP的Microlab STAR移液工作站。其在平臺(tái)上處理SBS標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)板。兩個(gè)Kendro培養(yǎng)箱整合到系統(tǒng)中（圖1）。系統(tǒng)的模塊化架構(gòu)允許將附加組件整合到臺(tái)面上，例如成像系統(tǒng)。

應(yīng)用軟件

該系統(tǒng)由標(biāo)準(zhǔn)PC和Hamilton開(kāi)放靈活的Microlab Venus軟件控制，用于過(guò)程控制和第三方組件整合。任何設(shè)計(jì)用于處理大量板的自動(dòng)化系統(tǒng)，每個(gè)板都經(jīng)歷復(fù)雜的操作且需具備數(shù)據(jù)跟蹤能力。Hamilton Celltask軟件可輕松安排重復(fù)過(guò)程，使細(xì)胞培養(yǎng)自動(dòng)化操作非常簡(jiǎn)便（圖4）。Celltrack軟件監(jiān)測(cè)并跟蹤每個(gè)板上的每個(gè)操作，并根據(jù)CFR 21第11部分的要求進(jìn)行數(shù)據(jù)文件記錄。

系統(tǒng)的生物驗(yàn)證

根據(jù)GLP，使用胚胎干細(xì)胞（最敏感的細(xì)胞培養(yǎng)范例之一）驗(yàn)證了Cellhost系統(tǒng)。已經(jīng)明確驗(yàn)證了生物可行性：

•  移液（接種、收集）后細(xì)胞的活力

•  更換培養(yǎng)基后細(xì)胞層完整

•  接種后細(xì)胞在孔中的均勻分布

•  使用可清洗鋼針時(shí)無(wú)交叉污染

結(jié)果

用Cellhost培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞在接種和更換培養(yǎng)基后保留其典型形態(tài)（圖5）。自發(fā)分化的程度不超過(guò)在人工處理的培養(yǎng)物中觀察到的程度。通過(guò)堿性磷酸酶活性的組織化學(xué)檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證多能狀態(tài)的維持。培養(yǎng)48小時(shí)后的細(xì)胞活力與手動(dòng)對(duì)照實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的相當(dāng)。未檢出污染。

通量和容量

6孔板2ml培養(yǎng)基的處理時(shí)間：

•  培養(yǎng)基更換：340s

•  細(xì)胞收集：1500s

•  滋養(yǎng)細(xì)胞制備：520s

•  胚胎干細(xì)胞（ESC）板的制備：940s

•  細(xì)胞培養(yǎng)箱可擴(kuò)展至容納1000個(gè)96孔板

討論

這項(xiàng)研究的結(jié)果表明了胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)自動(dòng)化的可行性。此處使用的系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)是基于手動(dòng)方法并且不需要液體補(bǔ)充模塊。細(xì)胞在各種移液步驟中容易存活，如機(jī)械接種和反復(fù)更換培養(yǎng)基。顯微鏡觀察顯示，胚胎干細(xì)胞的典型形態(tài)得以保留。此外，與手動(dòng)對(duì)照相比，未觀察到自發(fā)分化增加-這明確表明Cellhost溫和處理細(xì)胞。該系統(tǒng)以無(wú)污染的方式運(yùn)行?？梢灶A(yù)期，為胚胎干細(xì)胞精細(xì)培養(yǎng)而開(kāi)發(fā)的過(guò)程可以轉(zhuǎn)化為毒理學(xué)試驗(yàn)和藥物篩選中常用的不太敏感的細(xì)胞類(lèi)型。為進(jìn)一步自動(dòng)化細(xì)胞系（如CaCo2）和下游應(yīng)用（如報(bào)告基因分析）掃清了道路。隨著細(xì)胞培養(yǎng)的自動(dòng)化，制藥和生物技術(shù)公司的人工工作量大大減少。