人牙齦成纖維細(xì)胞的成骨分化可抑制破骨細(xì)胞形成

Osteogenic Differentiation of Human Gingival Fibroblasts Inhibits Osteoclast Formation

Keywords: gingival fibroblasts; osteoblasts; osteoclastogenesis; osteoclasts; osteogenesis.

牙齦成纖維細(xì)胞（GFs）是牙齦組織中較豐富的細(xì)胞類型之一，它們通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白來(lái)調(diào)節(jié)和維持組織的完整性。它們還通過(guò)調(diào)節(jié)白細(xì)胞的細(xì)胞粘附、產(chǎn)生大量活性氧和誘導(dǎo) T 細(xì)胞增殖來(lái)調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)。GFs 已被證明通過(guò)分泌白細(xì)胞介素-4（ IL-4）和骨保護(hù)素（OPG）來(lái)抑制破骨細(xì)胞分化，突出了其在健康個(gè)體中的骨骼保護(hù)能力。另一方面，GFs 能夠在牙齦卟啉單胞菌等口腔病原體存在下誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成。一般來(lái)說(shuō)，GFs 與周圍細(xì)胞之間的這種串?dāng)_在指導(dǎo)牙周組織炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度方面起著至關(guān)重要的作用。

此外，GFs 在分化成其他細(xì)胞類型（包括成骨細(xì)胞樣細(xì)胞）的潛力方面顯示出多功能性和可塑性。研究表明，分化成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的 GFs 高度表達(dá)成骨細(xì)胞相關(guān)基因。通過(guò)這種方式，GFs 有助于骨穩(wěn)態(tài)。

由于這兩個(gè)過(guò)程是否相互影響尚不清楚，因此，荷蘭阿姆斯特丹大學(xué)和阿姆斯特丹自由大學(xué)聯(lián)合牙科學(xué)術(shù)中心團(tuán)隊(duì)研究了 GFs 的成骨分化對(duì)其破骨細(xì)胞誘導(dǎo)能力的影響。具體地說(shuō)，該研究探索了成骨分化狀態(tài)（由礦化程度反映）如何影響 GFs 誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體分化為破骨細(xì)胞的能力。研究成果發(fā)表在 CELLS 期刊題為“Osteogenic Differentiation of Human Gingival Fibroblasts Inhibits Osteoclast Formation”。

首先，為了建立逐步礦化，將 GFs 分成四組培養(yǎng)3 周，在最后1周（min1）、2 周（min2）或全部3 周（min3）內(nèi)使用或不使用成骨培養(yǎng)基，設(shè)置對(duì)照培養(yǎng)基組（C）。通過(guò) ALP 活性、鈣濃度、掃描電子顯微鏡（SEM）、茜素紅染色和定量 PCR（qPCR）評(píng)估礦化情況。

在所有條件下培養(yǎng) 21 天后細(xì)胞數(shù)量增均有所加。在第21 天時(shí)，min3 條件下的細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖1 A）。在培養(yǎng)第 0 天和 21 天后測(cè)量 ALP 活性。與第 0 天相比，所有情況下的酶活性均顯著增加，并在GFs暴露于成骨培養(yǎng)基中時(shí)間最長(zhǎng)的 min3組中達(dá)到高水平（圖1 B）。

然后，評(píng)估成骨分化的成纖維細(xì)胞的 Ca2+ 沉積能力，發(fā)現(xiàn)Ca2+ 濃度隨著時(shí)間的推移顯著增加，與其他條件相比，濃度在 min3 中最高（圖1 C）。茜素紅染色同樣證實(shí)了這一點(diǎn)（圖1 D）。

SEM 圖像顯示，隨著時(shí)間的推移，礦化過(guò)程成功實(shí)現(xiàn)。隨著長(zhǎng)時(shí)間暴露于成骨培養(yǎng)基，礦物結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量和大小從 C 組累積增加到 min3組（圖1 E）。SEM 進(jìn)一步揭示，初始礦物沉積（min1）通常在細(xì)胞頂部，而不是在沉積的基質(zhì)上，在后期（min2 和 min3）更多地附著在基質(zhì)結(jié)構(gòu)上。

在第21天時(shí)測(cè)量早期成骨標(biāo)志物 Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）、基質(zhì)蛋白 I 型膠原蛋白（COL1A1）和晚期成骨標(biāo)志物骨連接素（Osteonectin）的基因表達(dá)水平，并沒(méi)有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異（圖1 F、G、H）。

總之，成骨結(jié)果表明，用成骨培養(yǎng)基培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá) 3 周會(huì)逐漸增加成骨參數(shù)，如鈣沉積測(cè)定所反映的礦物質(zhì)沉積。SEM 分析進(jìn)一步顯示，隨著時(shí)間的推移，結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)增加。

圖1    GFs 的成骨分化。

接下來(lái)，將 GFs 與含有破骨細(xì)胞前體的外周血單核細(xì)胞（PBMCs）共培養(yǎng)3 周，檢測(cè)破骨細(xì)胞形成。?TRAcP + 多核細(xì)胞的數(shù)量是衡量骨吸收和破骨細(xì)胞活性的重要指標(biāo)，因此，在第42 天時(shí)計(jì)算具有三個(gè)或更多細(xì)胞核的 TRAcP + 多核細(xì)胞的數(shù)量（圖2 A、B、C）。從對(duì)照組（C）到 min3 組，具有 3-5 個(gè)或超過(guò) 6 個(gè)細(xì)胞核的細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖2 B）。C 組和 min1 組破骨細(xì)胞形成最高，min3 組較低，其成骨培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)時(shí)間最長(zhǎng)（圖2 B）。

在第 28 天（與PBMCs 共培養(yǎng)1 周）和 42天（與PBMCs 培養(yǎng)3 周）時(shí)測(cè)量 TRAcP 活性，發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間點(diǎn)之間和不同條件之間沒(méi)有顯著差異，TRAcP 活性水平相似（圖2 C）。

由于 TNF-α 即使在沒(méi)有誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的 RANKL 情況下也能刺激破骨細(xì)胞形成，因此，研究人員進(jìn)一步評(píng)估了 TNF-α 的釋放是否受礦化機(jī)制的影響?？傮w而言，TNF-α 分泌在第35天（與PBMCs 共培養(yǎng)2 周）顯著高于第28天（與PBMCs共培養(yǎng)1 周）。在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，長(zhǎng)時(shí)間暴露于成骨培養(yǎng)基導(dǎo)致 TNF-α 分泌降低（圖2 D）。

在第21 天和第35 天（添加 PBMCs 后 14 天）測(cè)量破骨細(xì)胞發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)，第21 天僅涉及共培養(yǎng)開(kāi)始時(shí) GFs 單一培養(yǎng)中的表達(dá)，第35 天反映了 GFs 和 PBMCs 的共培養(yǎng)中的表達(dá)。RANKL 在 min3 組的表達(dá)顯著更高，表明長(zhǎng)時(shí)間暴露于成骨培養(yǎng)基會(huì)增加 RANKL 表達(dá)，但在第35天時(shí)，兩組間未觀察到顯著差異。此外，OPG 水平也在 min3 組最高，且在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，OPG 水平都比 RANKL 高幾倍。

圖2    GFs的成骨分化抑制破骨細(xì)胞的形成。

破骨細(xì)胞形成的另一個(gè)重要分子是細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1），它是 GFs 和 PBMCs 之間細(xì)胞間相互作用所必需的，第35 天時(shí)，min1 組的 ICAM-1 表達(dá)水平顯著高于min3 組；巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）蛋白表達(dá)對(duì)破骨細(xì)胞前體的增殖至關(guān)重要，其同樣在 min1 組中最高；基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）通過(guò)控制細(xì)胞-基質(zhì)相互作用和溶解骨基質(zhì)對(duì)破骨細(xì)胞遷移很重要，然而，MMP-2 表達(dá)水平在任何時(shí)間點(diǎn)上都沒(méi)有顯著差異；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）可替代 RANKL，阻斷其信號(hào)通路會(huì)抑制破骨細(xì)胞形成，在第21天時(shí)，TGF-β 表達(dá)水平在 min3 組最高；樹(shù)突狀細(xì)胞特異性跨膜蛋白（DC-STAMP）被認(rèn)為是細(xì)胞間融合的重要基因，在第35天時(shí)，其在C組和min2組的表達(dá)存在顯著差異；TRAcP 是破骨細(xì)胞活性的標(biāo)志物，其在第35天時(shí)在整個(gè)條件下水平相似。

t-PA、u-PA 及其受體 u-PAR 等纖維蛋白溶解因子在骨代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。這些因子參與破骨細(xì)胞前體向破骨細(xì)胞的分化，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)能力，并導(dǎo)致成骨細(xì)胞礦化細(xì)胞外基質(zhì)。這些因素的變化會(huì)影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能。為此，實(shí)驗(yàn)最后還研究了 t-PA、u-PA 及其受體 u-PAR 的基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)第21天時(shí)，t-PA、u-PA 及其受體 u-PAR 表達(dá)均在 min3 組最高。

圖3    圖形概要   GFs能夠獲得成骨表型，這導(dǎo)致破骨細(xì)胞形成減少。

這項(xiàng)研究描述了人類 GFs 的成骨分化對(duì)破骨細(xì)胞形成誘導(dǎo)能力的影響。研究首先表明 GFs 能夠在成骨刺激下獲得成骨表型。其次，在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，GFs 破骨細(xì)胞誘導(dǎo)能力就越弱。GFs 已被證明可以分化成成骨細(xì)胞樣細(xì)胞，以結(jié)節(jié)形式發(fā)生鈣沉積。它們的分化程度降低了它們誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的能力。這進(jìn)一步表明，通過(guò)適當(dāng)?shù)拇碳ぃ?span style="font-family: 宋體, SimSun; font-size: 17px;">GFs 有可能用于再生牙周治療。因此，未來(lái)的研究可能有助于確定調(diào)節(jié)分化過(guò)程及其對(duì)破骨細(xì)胞形成影響的確切機(jī)制和途徑。

參考文獻(xiàn)：Ceylan M, Schoenmaker T, Hogervorst JMA, Jansen IDC, Schimmel IM, Prins CM, Laine ML, de Vries TJ. Osteogenic Differentiation of Human Gingival Fibroblasts Inhibits Osteoclast Formation. Cells. 2024 Jun 24;13(13):1090. doi: 10.3390/cells13131090. PMID: 38994943; PMCID: PMC11240541.

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