免疫熒光技術(shù)實驗步驟與優(yōu)缺點

免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence，IF）又稱熒光抗體技術(shù)，是標記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光基團，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位。

原理：免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內(nèi)的相應抗原（或抗體）。在組織或細胞內(nèi)形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。

一、操作步驟：

1、細胞準備：對單層生長細胞，在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數(shù)生長細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。

1、固定：根據(jù)需要選擇適當?shù)墓潭▌┕潭毎?。固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5 min.

2、通透：使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.

3、封閉：使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min.

4、一抗結(jié)合：室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.

5、二抗結(jié)合：間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。

二、優(yōu)缺點：

優(yōu)點：

　　1、高靈敏度：免疫熒光技術(shù)對抗原的檢測具有很高的靈敏度，即使在極微量的抗原存在下也能進行檢測。

　　2、高特異性：由于抗體與抗原的特異性結(jié)合，免疫熒光技術(shù)可以準確地定位和檢測特定的蛋白質(zhì)或抗原。

　　3、可視化：該技術(shù)允許直接在細胞或組織中觀察靶標抗原，提供了直觀的視覺信息，有利于了解抗原的分布和定位。

　　4、雙重標記：可以同時使用兩種不同的熒光標記抗體，以在同一樣本中檢測兩種不同的抗原，這對于共定位研究非常有用。

　　5、適用性廣：免疫熒光技術(shù)廣泛應用于生物學和醫(yī)學研究，包括疾病診斷、細胞分選、蛋白質(zhì)相互作用和細胞生物學研究。

　　6、可定量：通過測量熒光強度，可以對抗原表達進行定量分析。

　　7、快速：一旦制備好樣品和抗體，免疫熒光實驗通?？梢栽趲仔r內(nèi)完成。

缺點：

　　1、信號衰減：熒光信號會隨時間衰減，尤其是在長時間曝光于激發(fā)光下，這要求在實驗過程中及時捕獲圖像。

　　2、非特異性背景：可能會發(fā)生非特異性結(jié)合，需要通過適當?shù)姆忾]和對照實驗來減少背景信號。

　　3、熒光淬滅：在某些條件下，熒光標記可能會淬滅，影響結(jié)果的可靠性。

　　4、需要特殊設備：免疫熒光顯微鏡和相關設備相對昂貴，可能不是所有實驗室都能配備。

　　5、樣品制備：樣品固定和處理過程可能影響抗原的檢測，需要仔細優(yōu)化條件。

　　6、不能保存長久：由于熒光信號會隨時間衰減，因此無法長期保存樣品進行復查。

　　7、有限的多重分析能力：盡管可以進行雙重或多重標記，但可用的熒光通道數(shù)量有限，這限制了同時檢測不同抗原的數(shù)量。

　　8、解釋主觀性：結(jié)果的解釋可能具有主觀性，依賴于觀察者對熒光信號的識別和解釋。

　　9、光毒性：長時間的光照可能對活細胞造成損傷，影響細胞生理狀態(tài)。