案例分享 | 質(zhì)粒提取的常見問題和解決方案！

柱式法質(zhì)粒提取主要基于SDS-堿裂解法。細胞在高pH的強陰離子洗滌劑SDS作用下，細胞壁被裂解，染色體DNA和蛋白質(zhì)發(fā)生變性并相互纏繞形成大型復合物。這些復合物在鉀離子取代鈉離子時從溶液中沉淀下來，而質(zhì)粒DNA則留在上清液中。由于DNA帶負電，質(zhì)粒提取柱中的硅基質(zhì)膜在高鹽條件下能選擇性地吸附DNA。通過去離子水洗脫，最終得到純化的質(zhì)粒DNA。

目前使用分光光度法定量質(zhì)粒DNA和通過瓊脂糖凝膠電泳進行質(zhì)粒DNA產(chǎn)率和質(zhì)量的分析是兩種常用的方法。

舉例：提取2 mL過夜培養(yǎng)的大腸桿菌PUC19質(zhì)粒，分光光度法檢測質(zhì)粒的得率，在15 μg左右，260/280=1.8~2.0，260/230=2.0~2.3；瓊脂糖凝膠電泳顯示三條帶，從上至下依次為：開環(huán)DNA、線性DNA、超螺旋DNA，其中超螺旋DNA的占比＞90%。

如圖所示，質(zhì)粒提取之后進行瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)明顯的RNA條帶，說明有RNA污染。

原因及解決方法：

（1）未在緩沖液 RS*中事先加入RNase A。解決方法：補加RNase A。

（2）加入RNase A的緩沖液 RS*長期保存于室溫，導致RNase A活性下降。解決方法：每次使用后置于 4℃保存。若長期不用，置于-20℃保存。

（3）細菌過量,RNase A不能有效降解RNA。解決方法：將細菌用量減半或增加RNase A在緩沖液 RS*中的濃度。

（1）菌體裂解和中和過程中,劇烈混合造成基因組DNA斷裂所致。解決方法：溫和地進行菌體的裂解和中和。

（2）加裂解液 LB時操作時間過長，造成基因組DNA斷裂所致。解決方法：將裂解步驟控制在5分鐘內(nèi)完成。

（3）細菌的質(zhì)量差（反復凍融的細菌，陳舊的細菌，培養(yǎng)條件不合適的細菌等）中有許多斷裂或降解而游離的基因組DNA，使用生長良好的新鮮細菌。

如圖右所示，質(zhì)粒提取之后進行瓊脂糖凝膠電泳，開環(huán)質(zhì)粒的占比約20%，說明超螺旋比例低，一般超螺旋比例需要＞90%，一般來說超螺旋比例越高，質(zhì)粒的穩(wěn)定性越高，高超螺旋比例的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染效率、基因表達水平等方面具有更好的表現(xiàn)。

原因：裂解時間不宜過長，加入裂解液后裂解時間不應超過5分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞

解決方法：優(yōu)化裂解時間；確保質(zhì)粒的結(jié)合和所有溶液都在室溫下進行，減少離心力對質(zhì)粒超螺旋結(jié)構(gòu)的影響，因為過度的離心可能會破壞質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)。

常規(guī)質(zhì)粒DNA純化中，質(zhì)粒DNA仍需要從55%蛋白質(zhì)、20%RNA、3%內(nèi)毒素和3%基因組DNA中分離，在質(zhì)粒DNA制備的菌體裂解過程中，內(nèi)毒素分子被釋放到溶菌液中。由于內(nèi)毒素常形成囊狀結(jié)構(gòu)，其分子量、電荷性和疏水性都與質(zhì)粒DNA相似，常用的純化方法很難將內(nèi)毒素與質(zhì)粒DNA分開。內(nèi)毒素會降低原代細胞和敏感培養(yǎng)細胞的轉(zhuǎn)染效率，干擾免疫細胞的體外轉(zhuǎn)染。由于實驗目的不同，對質(zhì)粒DNA的內(nèi)毒素要求亦不同，尤其是在細胞轉(zhuǎn)染、基因沉默研究、基因治療等過程中，對質(zhì)粒質(zhì)量、內(nèi)毒素水平要求更為苛刻，對于非敏感型的的轉(zhuǎn)染實驗，要求內(nèi)毒素殘留0.1～2.5 EU/ug，對于敏感型的的轉(zhuǎn)染實驗，要求內(nèi)毒素殘留＜0.1 EU/ug。

原因：內(nèi)毒素去除時操作不當或者未選擇合適的試劑

解決方法：

（1）如果采用的內(nèi)毒素清除的方法，離心之后，上層水相含DNA，下層藍色油狀相含內(nèi)毒素和其它雜質(zhì)。這時注意不要吸到藍色油狀層，里面含內(nèi)毒素等雜質(zhì)。

（2）在使用樹脂純化系統(tǒng)去除內(nèi)毒素時，需要先活化樹脂，然后使用平衡緩沖液平衡樹脂，以確保最佳的去除效率。

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柱式法

磁珠法