畢赤酵母表達系統(tǒng)及發(fā)酵工藝

一、畢赤酵母表達系統(tǒng)簡介

畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統(tǒng)作為一種高效的真核表達系統(tǒng)，畢赤酵母表達系統(tǒng)具有廣泛的應用領域和顯著的優(yōu)勢。與其他表達系統(tǒng)相比，畢赤酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)勢明顯。它擁有目前強、調(diào)控機理嚴格的啟動子之一 —— 醇氧化酶基因 AOX1 啟動子，這使得外源基因的表達調(diào)控更加精準高效。其表達水平高，既能實現(xiàn)胞內(nèi)表達，又可進行分泌型表達，極大地滿足了不同研究和生產(chǎn)的需求。發(fā)酵工藝成熟且易于放大，已經(jīng)具備大規(guī)模工業(yè)化高密度生產(chǎn)的能力，為產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了便利條件。培養(yǎng)成本低，產(chǎn)物易分離，所用發(fā)酵培養(yǎng)基廉價，且不含蛋白，有利于下游產(chǎn)品的分離純化，降低了生產(chǎn)成本。外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定，整合到畢赤酵母染色體上后，能隨染色體復制而穩(wěn)定存在，不易丟失。此外，作為真核表達系統(tǒng)，畢赤酵母還具有真核生物的亞細胞結(jié)構(gòu)，能夠?qū)Ρ磉_的蛋白進行糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工，使表達出的蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白，具有更高的生物活性。

二、畢赤酵母表達系統(tǒng)構(gòu)成

1、宿主菌

目前用于外源蛋白表達的畢赤酵母宿主菌有： Mut+甲醇利用型GS115、X-33、SMD1165、SMD1163及 SMD1168等大多宿主菌；MutS甲醇利用緩慢型KM71； Mut-甲醇不利用型MC100-3。詳見下表，詳細地列舉了畢赤酵母不同的表達宿主菌及表達特點

表 1常見的畢赤酵母表達宿主菌及特點

2、載體

畢赤酵母表達載體以整合型載體為主，常見載體可分為胞內(nèi)表達載體和分泌表達載體。

表 2 常見的畢赤酵母表達宿載體及特點

三、畢赤酵母發(fā)酵工藝

1、畢赤酵母發(fā)酵階段

畢赤酵母的發(fā)酵一般分兩個階段：1、細胞增長階段：首先在碳源為甘油或葡萄糖的培養(yǎng)基中進行的生長階段，積累足夠的細胞密度和生物量，在菌體濃度達到一定階段時，當甘油或葡萄糖耗盡時，會導致溶解氧值突然上升至100%左右，然后開始流加甘油或葡萄糖溶液，并保持通風量和攪拌速度，以維持溶解氧水平在30%左右，進一步增長生物量（菌濃）。2、誘導階段：當生物量達到要求后，停止補碳源，碳源耗盡，過渡期結(jié)束后，將碳源切換至甲醇進行誘導表達目標蛋白的發(fā)酵階段。一般間歇加入0.3%甲醇兩次誘導，然后開始流甲甲醇誘導表達蛋白，這種方式可以提高外源蛋白的表達水平，并且使得畢赤酵母在較短時間內(nèi)積累高濃度的目標蛋白。

誘導表達階段是畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)過程中的關鍵環(huán)節(jié)，在此階段，甲醇被用作特異性誘導劑，替代先前的碳源。畢赤酵母中的醇氧化酶基因（如 AOX1）在甲醇存在下被激活，從而驅(qū)動外源基因的高效表達。該階段的條件控制對于外源蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要影響，需要嚴格控制甲醇的添加量、添加速率以及發(fā)酵環(huán)境的溫度、pH 值和溶氧量等參數(shù)，以確保外源基因能夠持續(xù)、高效地表達，同時避免甲醇對細胞產(chǎn)生毒性以及其他不利影響。

2、發(fā)酵培養(yǎng)基的種類和配方

畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基的種類多樣，不同的培養(yǎng)基配方適用于不同的發(fā)酵階段和目的。

BSM（基礎鹽）培養(yǎng)基是畢赤酵母發(fā)酵常用的基礎培養(yǎng)基之一，其典型配方為：85％磷酸 26.7ml/l，二水硫酸鈣 0.93g/l，硫酸鉀 18.2g/l，七水硫酸鎂 14.9g/l，氫氧化鉀 4.13g/l，甘油 40.0g/l，PTM1 4.35ml/l。這種培養(yǎng)基能夠為畢赤酵母的生長提供基本的營養(yǎng)成分，包括氮源、磷源、鉀源、鎂源等無機鹽以及甘油作為碳源，PTM1 則補充了酵母生長所需的微量元素和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，有助于維持酵母細胞的正常生長和代謝。

F22 培養(yǎng)基也是一種常見的畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基，其配方在不同的研究和生產(chǎn)應用中可能會有所調(diào)整，但一般包含適量的碳源（如葡萄糖或甘油）、氮源（如酵母提取物、蛋白胨等）、無機鹽（如硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鉀等）以及其他添加劑（如生物素、微量元素溶液等）。與 BSM 培養(yǎng)基相比，F(xiàn)22 培養(yǎng)基在營養(yǎng)成分的組成和比例上可能有所優(yōu)化，以滿足特定的發(fā)酵需求，例如在某些情況下可能更有利于提高外源蛋白的表達量或改善蛋白的質(zhì)量。

除了上述兩種常見的培養(yǎng)基外，還有許多其他的畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基，這些培養(yǎng)基的配方往往是根據(jù)具體的實驗目的、菌株特性以及發(fā)酵工藝的要求進行優(yōu)化和調(diào)整的。例如，在一些研究中，為了提高畢赤酵母對特定底物的利用效率或增強其對環(huán)境壓力的耐受性，會在培養(yǎng)基中添加一些特殊的成分，如氨基酸、有機酸、多糖等；或者通過調(diào)整培養(yǎng)基中碳源、氮源和無機鹽的比例，來優(yōu)化酵母細胞的生長和代謝途徑，從而實現(xiàn)更高的發(fā)酵效率和產(chǎn)物產(chǎn)量。

3、發(fā)酵工藝參數(shù)

在畢赤酵母發(fā)酵過程中，工藝參數(shù)的精確控制對于發(fā)酵的成功與否起著至關重要的作用，這些參數(shù)包括 pH、溫度、溶氧等，它們相互關聯(lián)、相互影響，共同決定了畢赤酵母的生長狀況、代謝活性以及外源蛋白的表達水平。

pH值：是影響畢赤酵母發(fā)酵的關鍵因素之一。畢赤酵母在不同的生長階段和代謝過程中，對 pH 值的要求有所不同。在細胞生長階段，一般適宜的 pH范圍為 5.0 - 6.0，在此 pH 條件下，酵母細胞能夠保持良好的生長狀態(tài)，酶的活性也能得到較好的發(fā)揮，有利于細胞的增殖和代謝產(chǎn)物的積累。pH值在畢赤酵母的發(fā)酵過程中，不僅會影響菌體的生長狀態(tài)，而且對外源蛋白的表達也會產(chǎn)生重要影響。pH值對畢赤酵母的影響主要包括以下方面：（1)影響細胞內(nèi)酶的活性，進而影響細胞的新陳代謝，從而使外源蛋白的表達也受到影響；(2)影響細胞膜的通透性，對細胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)和排出代謝產(chǎn)物時產(chǎn)生一定的影響；（3)pH值會對培養(yǎng)基中成分和細胞的代謝產(chǎn)物的離解產(chǎn)生影響，從而對細胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)造成影響；（4)pH值也可能對細胞的代謝過程產(chǎn)生影響，使細胞代謝產(chǎn)物的含量發(fā)生改變另外，在高密度發(fā)酵過程中，為了減少外源蛋白被蛋白酶降解，應避開蛋白酶作用的最適pH值，將pH 值設定在偏離外源蛋白等電點處，也會提高外源蛋 白的收獲率。

溫度：對畢赤酵母的生長和代謝也具有顯著影響。畢赤酵母的生長溫度一般在 28 - 30℃之間較為適宜。在這個溫度范圍內(nèi)，酵母細胞的生長速度較快，代謝活動旺盛，能夠高效地利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)進行生長和繁殖。然而，如果溫度過高，超過 32℃，可能會導致細胞死亡，因為高溫會破壞細胞的膜結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的穩(wěn)定性，從而影響細胞的正常生理功能。相反，在較低的溫度下，雖然細胞的生長速度會減慢，但一些研究表明，適當降低培養(yǎng)溫度可以改善靶蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量。這是因為低溫可以降低細胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊的應力，減少錯誤折疊的發(fā)生，同時也能減少蛋白酶的活性，降低外源蛋白的水解程度，從而有利于外源蛋白的正確折疊和積累。

溶氧（DO）：是畢赤酵母發(fā)酵過程中另一個關鍵的工藝參數(shù)。畢赤酵母在利用甘油和甲醇進行生長和代謝時都需要氧氣的參與，因此維持合適的溶氧水平對于確保發(fā)酵的順利進行至關重要。在整個發(fā)酵過程中，通常需要將溶氧濃度維持在＞20% 的水平。在細胞生長初期，由于菌體數(shù)量較少，對氧氣的需求相對較低，此時通過適當?shù)耐夂蛿嚢杓纯蓾M足細胞的溶氧需求。隨著細胞的生長和代謝活動的增強，對氧氣的消耗逐漸增加，此時需要進一步調(diào)整通氣量、攪拌速度或采用純氧補充等方式來提高溶氧水平，以保證細胞能夠獲得足夠的氧氣進行代謝。如果溶氧不足，可能會導致細胞生長緩慢、代謝產(chǎn)物積累減少，甚至會引起細胞死亡，從而嚴重影響發(fā)酵的效率和產(chǎn)物的產(chǎn)量。

培養(yǎng)時間：是在畢赤酵母表達系統(tǒng)中獲得最高蛋白表達水平的最關鍵因素之一，在畢赤酵母表達系 統(tǒng)中，生產(chǎn)時間相對較長（約100h）。培養(yǎng)時間與 酵母細胞的數(shù)量和目標蛋白的降解程度有關，有研 究表明，巴斯德畢赤酵母細胞的最高生長密度是培 養(yǎng)96h，而最高蛋白表達發(fā)生在48h［11]，這表明 較長的培養(yǎng)時間很可能會導致所表達蛋白被水解消 化，也有其他的研究表明最佳蛋白質(zhì)表達時間發(fā)生 在培養(yǎng)72~96 h[2

畢赤酵母發(fā)酵工藝是一個復雜而精細的過程，需要對發(fā)酵階段、培養(yǎng)基配方和工藝參數(shù)進行精確的控制和優(yōu)化，可以通過實驗設計（DOE）方法，系統(tǒng)地優(yōu)化發(fā)酵條件，如pH、溫度、溶氧和培養(yǎng)基組成以充分發(fā)揮畢赤酵母的優(yōu)勢，實現(xiàn)外源蛋白的高效表達和生產(chǎn)。通過深入了解畢赤酵母的發(fā)酵特性和需求，結(jié)合先進的發(fā)酵技術(shù)和設備，不斷優(yōu)化發(fā)酵工藝，有望進一步提高畢赤酵母發(fā)酵的效率和產(chǎn)物質(zhì)量。

四、畢赤酵母與發(fā)酵罐的 “默契配合”

在畢赤酵母的發(fā)酵過程中，發(fā)酵罐作為核心設備，為畢赤酵母的生長和代謝提供了關鍵的環(huán)境條件，確保其能夠高效表達外源蛋白。

發(fā)酵罐通過精確的溫度控制系統(tǒng)，為畢赤酵母提供適宜的生長溫度。如前所述，畢赤酵母在 28 - 30℃的生長階段以及在誘導表達階段對溫度的特定要求，發(fā)酵罐的溫控系統(tǒng)能夠精準地維持在這些設定溫度范圍內(nèi)，避免溫度過高或過低對酵母細胞生長和蛋白表達的不利影響。在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中，這種精確的溫度控制尤為重要，它保證了每一批次的畢赤酵母都能在穩(wěn)定且適宜的溫度環(huán)境下生長，從而提高了生產(chǎn)的穩(wěn)定性和重復性。

對于 pH 值的調(diào)控，發(fā)酵罐配備了先進的 pH 檢測和調(diào)節(jié)裝置。在畢赤酵母發(fā)酵的不同階段，根據(jù)其對 pH 值的需求變化，發(fā)酵罐能夠自動添加酸堿溶液，將 pH 值精確維持在所需范圍內(nèi)。在細胞生長階段保持 pH 5.0 - 6.0，誘導表達階段調(diào)整到 3.0 - 5.0，這種精準的 pH 控制有助于維持酵母細胞內(nèi)酶的活性，促進細胞的正常生長和代謝，同時減少外源蛋白的降解，提高蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量。

溶氧水平的控制也是發(fā)酵罐的關鍵功能之一。畢赤酵母在發(fā)酵過程中對溶氧需求較高，發(fā)酵罐通過合理的通氣系統(tǒng)和攪拌裝置，確保溶氧濃度始終維持在＞20% 的水平。通氣系統(tǒng)能夠向發(fā)酵液中均勻地通入空氣或氧氣，而攪拌裝置則通過不斷攪拌，使氧氣在發(fā)酵液中充分分散，提高氧氣的傳遞效率，滿足畢赤酵母在不同生長階段對氧氣的需求，保證其代謝活動的正常進行，進而促進外源蛋白的高效表達。

攪拌和通氣系統(tǒng)的協(xié)同作用還能保證發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)均勻分布，避免出現(xiàn)局部營養(yǎng)缺乏或過剩的情況，使每一個畢赤酵母細胞都能在良好的營養(yǎng)環(huán)境下生長。同時，發(fā)酵罐的密封性能也十分重要，它能夠防止外界雜菌的污染，確保畢赤酵母發(fā)酵過程的純凈性和穩(wěn)定性，避免因染菌而導致的發(fā)酵失敗或產(chǎn)物質(zhì)量下降等問題。

錦維生工的發(fā)酵罐產(chǎn)品正是基于這些關鍵需求進行設計和制造的，擁有先進的溫度控制、pH 調(diào)節(jié)、溶氧控制以及高效的攪拌和通氣系統(tǒng)，能夠為畢赤酵母的發(fā)酵提供優(yōu)化的環(huán)境條件，幫助用戶實現(xiàn)高效、穩(wěn)定的畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)，無論是在實驗室小試階段還是工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)中，都能發(fā)揮出的性能，滿足不同用戶對畢赤酵母發(fā)酵的各種需求，助力生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展。我們將持續(xù)關注畢赤酵母的研究動態(tài)和應用需求，不斷優(yōu)化和創(chuàng)新發(fā)酵罐的設計與制造技術(shù)，提升發(fā)酵罐的性能和穩(wěn)定性，為畢赤酵母的發(fā)酵生產(chǎn)提供更加先進、高效的設備支持，共同推動生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)邁向更加輝煌的未來。

錦維生工發(fā)酵罐介紹
Jimway-be® Lab系列 ------ 桌面級反應器 

Jimway-be® PM系列 ------多聯(lián)生物反應器 
 

適用場合：原核/真核細胞的培養(yǎng)和發(fā)酵和表達

培養(yǎng)皿容積: 250ml/500ml/1L/3L/5L/10L

單元數(shù)量： 2-16聯(lián)

培養(yǎng)方式： 懸浮&貼壁

槳葉類型： 三斜葉、六斜葉、六平葉、半管式、提升槳等多種組合

傳動方式：磁力耦合驅(qū)動/機械攪拌

控制策略：PID&階梯式控制策略（補料、攪拌轉(zhuǎn)速、溫度、通氣等）

補料控制：精確補料控制（誤差±1g）

功能特點：

界面簡潔：幾分鐘掌握操作，事半功倍

無人值守：可遠程訪問、操作，實現(xiàn)無人值守

配方功能：配方一鍵下發(fā)，減少人員操作失誤，提高品質(zhì)

數(shù)據(jù)分析：實現(xiàn)多批次數(shù)據(jù)對比，也可外接Doe&PAT實現(xiàn)深度多變量分析，優(yōu)化工藝數(shù)據(jù)

數(shù)據(jù)分享：基于VPN的WEB發(fā)布，在保證數(shù)據(jù)安全和設備安全的情況下，實現(xiàn)移動端(Android、IOS、Windows)的監(jiān)控和歷史曲線查看