CAR-T治療的幕后英雄：慢病毒載體培養(yǎng)及純化

前  言

慢病毒載體使得真核細胞基因修飾、表達變得更簡單，在實驗室研究、工業(yè)生產(chǎn)和臨床治療中應(yīng)用越來越廣泛。比如第三代自滅活慢病毒載體用于造血干細胞的基因修飾，治療原發(fā)性免疫缺陷和血紅蛋白病。慢病毒載體作為CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)T細胞的載體，是CAR-T細胞生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵原料，對實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)、縮短生產(chǎn)周期具有重要意義。

01慢病毒載體和CAR-T

慢病毒載體是一種源于人類免疫缺陷病毒（HIV）的基因載體。在構(gòu)建慢病毒載體時，為了避免產(chǎn)生有復(fù)制能力的病毒，會把HIV-1基因組分裝與不同的質(zhì)粒中，再共轉(zhuǎn)染細胞，獲得只有一次感染能力而無復(fù)制能力的慢病毒載體。目前慢病毒載體已從兩質(zhì)粒系統(tǒng)發(fā)展到四質(zhì)粒系統(tǒng)，安全性不斷提高。目前常用的是四質(zhì)粒系統(tǒng)，有更廣泛的應(yīng)用，比如基因編輯、基因治療、轉(zhuǎn)基因動物、藥物研究、CAR-T細胞治療等。

慢病毒載體有更廣泛的宿主，能夠感染分裂和非分裂細胞。對于難轉(zhuǎn)染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，能極大的提高目的基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。慢病毒可以將外源基因有效的整合到細胞染色體中，在靶細胞中獲得持續(xù)高效穩(wěn)定的表達。慢病毒載體還可以攜帶5kb以上的目的基因，將cDNA克隆到慢病毒載體中。

慢病毒載體的生產(chǎn)和用途示意圖（源自參考文獻）

CAR-T細胞治療在多種癌癥的臨床上取得成功，是目前醫(yī)學(xué)研究前沿?zé)衢T的方向之一。CAR-T生產(chǎn)制備流程主要包括T細胞富集、分化、擴增，通過病毒或非病毒載體進行CAR基因轉(zhuǎn)移，然后再進行體外CAR-T細胞擴增，最終制成細胞產(chǎn)品。因此將特定的CAR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進入T細胞的病毒載體是整個生產(chǎn)過程的關(guān)鍵原料。目前大部分CAR-T細胞的制備使用慢病毒載體，如諾華的Kymriah和Juno的Breyanzi，依靠慢病毒載體完成CAR-T細胞制造。

CAR-T細胞治療示意圖（源自參考文獻）

02慢病毒載體生產(chǎn)制備

慢病毒載體作為CAR-T的核心環(huán)節(jié)，其質(zhì)量對細胞產(chǎn)品及其治療效果具有直接影響。雖然生產(chǎn)慢病毒載體的步驟并不復(fù)雜，但如何大規(guī)模生產(chǎn)符合cGMP要求的高質(zhì)量慢病毒載體仍具有挑戰(zhàn)性。

慢病毒的生產(chǎn)是一個持續(xù)幾天的細胞培養(yǎng)過程，將病毒載體轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中。主要有貼壁和懸浮兩種培養(yǎng)方式。小規(guī)模研究可以選擇貼壁培養(yǎng)，但大規(guī)模生產(chǎn)需要懸浮培養(yǎng)。

慢病毒的大規(guī)模生產(chǎn)常用HEK293T細胞系，可以在沒有貼壁的情況下迅速懸浮生長。將包裝細胞在培養(yǎng)基中傳代數(shù)次，達到一定數(shù)量后，用病毒包裝質(zhì)粒和目的基因載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞。在幾天的培養(yǎng)過程中，包裝細胞會產(chǎn)生大量慢病毒顆粒，可以從培養(yǎng)基中收獲。病毒載體純化可使用多種方法，例如梯度純化法或色譜法。

除了細胞系，慢病毒的懸浮無血清培養(yǎng)已逐步替代傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)模式。懸浮培養(yǎng)能夠降低成本和污染風(fēng)險，培養(yǎng)及純化步驟更簡單，更容易放大。在成本方面，培養(yǎng)基是不可忽略的因素，選擇來源和化學(xué)成分明確、不含血清的培養(yǎng)基，會極大的降低成本和簡化下游純化工藝，并降低污染風(fēng)險。義翹神州已成功開發(fā)多款適用于HEK293細胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，屬于無血清、無抗生素、無動物源性組分的即用型培養(yǎng)基，可用于慢病毒載體大規(guī)模懸浮培養(yǎng)。

大規(guī)模生產(chǎn)還需要考慮雜質(zhì)去除，比如宿主DNA，在200L的反應(yīng)器中需要750mg的質(zhì)粒DNA，意味著轉(zhuǎn)染過程中會有大量的殘留，因此需要選擇合適的核酸酶進行去除。

總的來說，理化性質(zhì)不穩(wěn)定，回收率低，培養(yǎng)體系和純化工藝等未攻克的問題，依舊是慢病毒規(guī)?；a(chǎn)的瓶頸和關(guān)鍵。

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參考文獻：

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2. Natalia Elizalde and Juan Carlos Ramírez. Lentiviral vectors: key challenges and new developments.

3. Michael C. Milone and  Una O’Doherty. Clinical use of lentiviral vectors.

4. David Escors, Karine Breckpot. Lentiviral vectors in gene therapy: their current status and future potential.

5. Merten OW, Hebben M, Bovolenta C. Production of Sakuma,T.,Barry, M. A. and Ikeda, Y. Lentiviral vectors : basic to translational.