雙向瓊脂和單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)注意事項(xiàng)

利用可溶性抗原與抗體在半固體瓊脂內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)散，若抗原與抗體對(duì)應(yīng)，并且比例適當(dāng)，就會(huì)出現(xiàn)白色沉淀線，此為陽(yáng)性反應(yīng)。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)可在試管內(nèi)、平皿中以及玻片上的瓊脂中進(jìn)行。又可分為雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)兩類。

　　一、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)分類

　　1、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：是將半固體瓊脂傾注于平皿內(nèi)或玻片上，待其凝固后，在瓊脂板上打孔，將抗原、抗體分別注入小孔內(nèi)，使兩者相互擴(kuò)散。如果抗原、抗體相互對(duì)應(yīng)，濃度、比例適當(dāng)，則一定時(shí)間后，在抗原、抗體孔之間出現(xiàn)清晰可見的沉淀線。雙向瓊脂擴(kuò)散法可用來(lái)分析溶液中的多種抗原。一對(duì)抗原、抗體系統(tǒng)只能形成一條沉淀線，不同的抗原抗體系統(tǒng)在瓊脂中擴(kuò)散的速度不同，可在瓊脂中形成不同的沉淀線。本法主要是用于檢測(cè)血清中各種免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙肝表面抗原等。缺點(diǎn)是需要時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，靈敏度不高。

　　2、單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：是一種常用的定量檢測(cè)抗原的方法。將適量抗體與瓊脂混勻，澆注成板，凝固后，在板上打孔，孔中加入抗原，抗原就會(huì)向孔的四周擴(kuò)散，邊擴(kuò)散邊與瓊脂中的抗體結(jié)合。一定時(shí)間后，在兩者比例適當(dāng)處形成白色沉淀環(huán)。沉淀環(huán)的直徑與抗原的濃度成正比。如事先用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，則從曲線中可求出標(biāo)本中抗原的含量。單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)主要用于檢測(cè)標(biāo)本中各種免疫球蛋白和血清中各種補(bǔ)體成分的含量，敏感性很高。

　　二、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法

　　材料與試劑

　　1 瓊脂粉

　　2 打孔器

　　3 平皿

　　4 生理鹽水或其他緩沖液，可加萬(wàn)分之一的硫柳汞或疊氮鈉防腐。

　　操作方法：

　　1、稱取一定量的瓊脂粉，按1%左右（0.8%～1.5%）的比例加入生理鹽水或緩沖液，水浴煮沸融化20min。

　　2、將融化的瓊脂倒入平皿內(nèi)，使厚度2mm～3mm。自然冷卻。

　　3、根據(jù)要求（孔徑即孔的直徑，孔距即兩孔圓心之間的距離，包括兩孔的半徑）按模板打孔。也可直接用組合打孔器打孔?，F(xiàn)在一般多打成梅花形孔圖。

　　4、挑出孔內(nèi)瓊脂，注意不要挑破孔緣。

　　5、在火焰上緩緩加熱，使孔底邊緣的瓊脂少許熔化，以封底，以免加樣后液體從孔底滲漏。

　　6、以毛細(xì)滴管吸取樣品加入孔內(nèi)，注意不要產(chǎn)生氣泡，以加滿為度。加少了，影響反應(yīng)程度，加多了，易溢出，也影響反應(yīng)結(jié)果。

　　7、加畢后，蓋上平皿蓋，將平皿翻過(guò)來(lái)，置濕盤中，37℃自由擴(kuò)散24h～48h。

　　三、結(jié)果判定

　　1、用以檢測(cè)抗原或比較抗原差異時(shí)，將抗血清置中心孔，將待測(cè)抗原或需比較的抗原置于周圍相鄰孔。若出現(xiàn)沉淀帶*融合，證明為同種抗原；若二者有部分相連，表明二者有共同抗原決定簇；若二條沉淀線相互交叉，說(shuō)明二者抗原*不同。

　　2、用做血清流行病學(xué)調(diào)查時(shí)，將標(biāo)準(zhǔn)抗原置中心孔，周圍1、3、5孔加標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，2、4、6孔分別加待檢血清。待檢孔與陽(yáng)性孔出現(xiàn)的沉淀帶*融合者判為陽(yáng)性。待檢血清無(wú)沉淀帶或所出現(xiàn)的沉淀帶與陽(yáng)性對(duì)照的沉淀帶*交叉者判為陰性。待檢孔雖未出現(xiàn)沉淀帶，但兩陽(yáng)性孔的沉淀帶在接近待檢孔時(shí)，兩端均內(nèi)向有所彎曲者判弱陽(yáng)性。若僅一端有所彎曲，另一端仍為直線者，判為可疑，需重檢。重檢時(shí)，可加大檢樣的量。

　　檢樣孔無(wú)沉淀帶，但兩側(cè)陽(yáng)性孔的沉淀帶在接近檢樣孔時(shí)變得模糊、消失，可能為待檢血清中抗體濃度過(guò)大，致使沉淀帶溶解，可將樣品稀釋后重檢。

　　3、用以檢測(cè)抗血清的效價(jià)時(shí)，將抗原置中心孔，抗血清倍比稀釋后置周圍孔，以出現(xiàn)沉淀帶的血清最高稀釋倍數(shù)為該抗血清的瓊擴(kuò)效價(jià)。

　　四、注意事項(xiàng)：不規(guī)則的沉淀線可能是加樣過(guò)滿溢出、孔型不規(guī)則、邊緣開裂、孔底滲漏、孵育時(shí)沒放水平、擴(kuò)散時(shí)瓊脂變干燥、溫度過(guò)高蛋白質(zhì)變性或未加防腐劑導(dǎo)致細(xì)菌污染等所致。