酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）實(shí)驗(yàn)操作重點(diǎn)之一加樣解讀

         酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）是免疫學(xué)和分子生物學(xué)中廣泛使用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識(shí)別和結(jié)合原理，對(duì)待測(cè)抗體或者抗原進(jìn)行分析測(cè)定的方法，酶聯(lián)免疫吸附分析（下稱ELISA）是免疫分析的一種，分三個(gè)部分組成：免疫識(shí)別，信號(hào)輸出和數(shù)據(jù)處理。

       ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定操作簡(jiǎn)單，一般涉及到樣本的收集保存、試劑準(zhǔn)備、加樣、溫育、洗板、顯色、結(jié)果判斷和結(jié)果報(bào)告及解釋等方面，其中任一步驟的不當(dāng)都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。

一、ELISA實(shí)驗(yàn)加樣過程：

ELISA實(shí)驗(yàn)中一般需要 4 次加樣，即加樣本、加檢測(cè)抗體、加底物和加終止液。

                                             ELISA加樣

● 實(shí)驗(yàn)室使用的微量加樣器應(yīng)注意保養(yǎng)并定期校正。ELISA比較敏感，每孔加入液體量誤差會(huì)導(dǎo)致最后讀數(shù)差別，因此避免儀器帶來誤差。

●  加樣前，溶液充分混勻，加樣時(shí)不可90度向孔中滴加液體，否則會(huì)導(dǎo)致液體殘留在吸頭上，加樣不準(zhǔn)確。正確加樣方法應(yīng)為45度，吸頭貼著孔壁和液面的交界處加入。

●  加樣品時(shí)，單孔用量要求：≥50ul/指標(biāo)，如需要做復(fù)孔則所需樣本量≥100ul/指標(biāo)。如果樣本量不充足，具體用量可咨詢您的專屬銷售。

●  加樣時(shí)速度不可過快，否則無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。

●  加樣時(shí)避免液體濺出，如有樣本濺出，應(yīng)用吸水紙輕輕拭干，并做相應(yīng)記錄。

●  每次加樣順序一致，尤其底物、終止液順序一致，保證每個(gè)孔顯色時(shí)間相同。

●  加完顯色液后，放入一個(gè)可推拉的抽屜內(nèi)，就可以避光振蕩了。

二、ELISA實(shí)驗(yàn)加樣技巧：

●  用一張寫滿字的紙，字越多越好，比如報(bào)紙，墊在下面，這樣，加過標(biāo)本的小孔看過去下面的字會(huì)變小，沒加的字正常，非常容易區(qū)分。

●  可以利用液面反光與沒有加的孔加以區(qū)別。

三、ELISA實(shí)驗(yàn)加樣問題解答：

以下問題可能因多種原因引起，本文僅討論加樣的解決方法：

Q： 同一個(gè)樣本間的各個(gè)復(fù)孔的讀數(shù)有顯著性差異？

A： 加樣量多少不一，操作時(shí)間長(zhǎng)短不一。重復(fù)同一樣本時(shí)，加樣量與加樣時(shí)間理應(yīng)相同，同時(shí)也應(yīng)注意移液器的校準(zhǔn)。加樣后可輕微晃動(dòng)酶標(biāo)板使反應(yīng)液充分混合。

Q： 陽性對(duì)照讀數(shù)不正常？

A： 加樣量不正確。應(yīng)保持每次加樣的步驟不要有太大的差異，有條件的應(yīng)該考慮使用排槍。

Q： 血清本底高？

A： 加樣時(shí)使用同一槍頭、交叉污染。每次吸樣注意更換吸頭，做到一樣一吸頭，避免交叉污染。

Q： 實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定的重復(fù)性差？

A： 1. 可能原因：加樣本及試劑量不準(zhǔn)；孔間不一致；校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時(shí)要緊密；重復(fù)某一樣品時(shí)，加樣時(shí)間盡可能與第一次接近；重復(fù)測(cè)定標(biāo)本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性；樣品稀釋前應(yīng)充分混勻。

2. 可能原因：加樣過快，孔間發(fā)生污染；重復(fù)測(cè)定標(biāo)本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性；加樣不要過快。

3. 可能原因：加錯(cuò)樣本；檢查記錄和試劑，是否加錯(cuò)樣本。

4. 可能原因：加樣本及試劑時(shí)，加在孔壁上部非包被區(qū)；加樣槍頭不要貼壁。