miRNA實(shí)驗(yàn)解決方案（操作手冊(cè)）---第三章：miRNA 逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量 PCR

一、miRNA 逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量 PCR的概念
miRNA逆轉(zhuǎn)錄的概念
成熟miRNA的長(zhǎng)度只有21~23nt，對(duì)miRNA進(jìn)行qPCR定量時(shí)，無(wú)法直接對(duì)其進(jìn)行正、反向引物的設(shè)計(jì)（通常正向引物就足以覆蓋miRNA全長(zhǎng)），但是可以通過(guò)增加逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長(zhǎng)度來(lái)解決這一問(wèn)題，miRNA的逆轉(zhuǎn)錄方法有兩種，分別是莖環(huán)法和加尾法。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的概念
實(shí)時(shí)熒光定量PCR即Real-time PCR,利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)Cr值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模版進(jìn)行定量分析的方法。

二、miRNA逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理

莖環(huán)法原理

莖環(huán)法miRNA逆轉(zhuǎn)錄最關(guān)鍵的一步就是設(shè)計(jì)莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物（由莖環(huán)結(jié)構(gòu)和miRNA的3'末端六個(gè)反向互補(bǔ)的堿基組成），莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物首先與miRNA的3'末端結(jié)合，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行反應(yīng)，獲得人為加長(zhǎng)的miRNA第一鏈cDNA。針對(duì)不同的miRNA，需要設(shè)計(jì)不同的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物、配制不同的逆轉(zhuǎn)錄體系，因此莖環(huán)法miRNA逆轉(zhuǎn)錄具有特別高的特異性。

注：莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物中的莖環(huán)結(jié)構(gòu)為固定已知序列，只需按照不同的miRNA序列3'末端的六個(gè)堿基，將其反向互補(bǔ)添加至莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列的3'端即可設(shè)計(jì)出特異性的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物。

加尾法原理

增加miRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長(zhǎng)度最直接的方法就是增加miRNA的長(zhǎng)度，加尾法首先通過(guò)Poly（A）聚合酶（PAP）向miRNA的3'末端添加Poly（A）尾，然后在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄引物（由3'端帶有錨定堿基的Oligo dT序列和一段通用序列組成），即可獲得加長(zhǎng)版的cDNA。加尾法逆轉(zhuǎn)錄可以對(duì)提取純化的所有miRNA進(jìn)行無(wú)差別加尾，能夠同時(shí)逆轉(zhuǎn)樣本中多個(gè)miRNA，一次逆轉(zhuǎn)錄即可完成對(duì)所有qPCR模板的制備。

注：錨定堿基NV（V代表A、G或C，N代表ATGC中的任意一種）能夠特異性的結(jié)合到Poly（A）的5'端，以免逆轉(zhuǎn)出更多的T堿基，保證同一miRNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小相同；在Oligo dT序列的5'端存在一段可用于qPCR檢測(cè)的反向通用引物與cDNA的結(jié)合。


2、熒光定量PCR的化學(xué)原理

變產(chǎn)物DNA分子為熒光信號(hào)，通過(guò)測(cè)定熒光值即可反映產(chǎn)物DNA分子量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)方法有兩種，分別是SYBR®Green染料法和 TaqMan®Probe探針?lè)ā?/span>

SYBR®Green 染料法原理

一種DNA小溝非飽和性結(jié)合染料，與DNA結(jié)合時(shí)發(fā)光，不結(jié)合（游離）時(shí)不發(fā)光，每形成一條DNA雙鏈，就會(huì)有一定數(shù)量的染料結(jié)合上去，染料一結(jié)合，就會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)，信號(hào)強(qiáng)度與DNA分子總數(shù)目成正比。

TaqMan®Probe探針?lè)ㄔ?/strong>

一種水解探針（5'Reporter，3'Quencher），完整時(shí)不發(fā)光，水解后發(fā)光，每形成一條DNA鏈，就會(huì)水解一條探針，每水解一條探針，就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)單位信號(hào)，信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合過(guò)探針的DNA分子總數(shù)目成正比。

注：探針要先于引物結(jié)合在模板上，因此Tm（探針）要比Tm（引物）大8～10℃。

SYBR®Green 染料法 VS TaqMan®Probe探針?lè)ㄔ?/strong>

SYBR®Green 染料法：表達(dá)量比較高時(shí)推薦使用；

TaqMan®Probe 探針?lè)ㄔ恚?/span>表達(dá)量比較低時(shí)推薦使用；

三、miRNA逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR的操作流程
1.莖環(huán)法miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
Vazyme 莖環(huán)法 miRNA cDNA 一鏈合成的專用試劑盒 ----------miRNA 1st Stand cDNA Synthesis kit（by stem-loop）(Vazyme #MR101)

Vazyme #MR101 產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

1.優(yōu)秀的線性關(guān)系：在寬廣的模版區(qū)間內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，可檢出低至pg級(jí)RNA模版。

2.優(yōu)秀的反應(yīng)體系：最適的Buffer組分及濃度，更適用于miRNA的逆轉(zhuǎn)錄。

3.簡(jiǎn)便的引物設(shè)計(jì)：提供配套的引物設(shè)計(jì)軟件，使得引物設(shè)計(jì)更加簡(jiǎn)便。

Vazyme #MR101實(shí)驗(yàn)案例-----優(yōu)秀的線性關(guān)系

以小鼠肝臟組織Total RNA的10倍稀釋梯度（10pg～1μg）為模板，使用miRNA 1st StrandcDNA Synthesis Kit （by stem-loop） （Vazyme ＃MR101）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA使用miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme ＃MQ101）擴(kuò)增mmu-miR-16基因。結(jié)果顯示， 在寬廣的模板區(qū)間內(nèi)，該配套產(chǎn)品具有優(yōu)異的線性關(guān)系。

·注意事項(xiàng)

1．防止RNase污染：保持實(shí)驗(yàn)區(qū)域潔凈；操作時(shí)需穿戴干凈的手套、口罩；實(shí)驗(yàn)所用的離心管、槍頭等耗材均需保證RNase-free。

2.5xgDNA Wiper Mix的使用：5xgDNA Wiper Mix含有高濃度的甘油，使用前請(qǐng)短暫離心收集到反應(yīng)管底部，并用移液器輕輕吹打混勻。不應(yīng)使槍頭插入液面過(guò)深，否則會(huì)因槍頭壁的粘附造成酶量的損失。

3．反應(yīng)液的配制請(qǐng)?jiān)诒喜僮魍瓿伞?/span>

·實(shí)驗(yàn)流程

1．基因組DNA去除

a.在RNase-free 離心管中配制如下混合液：

用移液器輕輕吹打混勻。

b.按下列條件進(jìn)行基因組DNA去除反應(yīng)：42°C 2min。

2.第一鏈cDNA合成

a.在RNase-free離心管中配制如下混合液：

莖環(huán)引物推薦使用本公司miRNA Design軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，此時(shí)，cDNA產(chǎn)物后續(xù)定量產(chǎn)品--miRNAUniversal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme ＃MQ101）中配套的逆向qPCR引物可直接使用，無(wú)需另外設(shè)計(jì)合成。
用移液器輕輕吹打混勻。

b.按下列條件進(jìn)行第一鏈cDNA合成反應(yīng)：

如果模版具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)或高GC區(qū)域，可將反應(yīng)溫度提高至55°C，有助于提高產(chǎn)量。
產(chǎn)物可立即用于qPCR反應(yīng)，短期保存建議存放-20°C；長(zhǎng)期保存建議存放-70°C；cDNA應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2、加尾法miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

Vazyme 加尾法 miRNA逆轉(zhuǎn)錄是無(wú)法使用普通的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的，因?yàn)槠淙鄙?/span>Poly（A）聚合酶，無(wú)法添加Poly（A）尾。Vazyme為您提供加尾法miRNA合成cDNA的專用試劑盒-miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by tailing A）（Vazyme ＃MR201）。

·Vazyme ＃MR201 產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

1．特別優(yōu)秀的逆轉(zhuǎn)錄性能：逆轉(zhuǎn)錄效率高且熔解曲線單峰。

2．超高的逆轉(zhuǎn)錄特異性：專為miRNA逆轉(zhuǎn)錄定向改造的逆轉(zhuǎn)錄酶，搭配優(yōu)化的緩沖體系，在保證高靈敏度的同時(shí)，最大限度降低 miRNA前體的逆轉(zhuǎn)錄。

3．簡(jiǎn)便快捷的操作：加尾反應(yīng)與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)一管進(jìn)行，使得操作更加方便。

·Vazyme ＃MR201 實(shí)驗(yàn)案例一一超高的逆轉(zhuǎn)錄特異性

以HeLa miRNA為模板（100ng／μl），分別使用專為miRNA逆轉(zhuǎn)錄定向改造的逆轉(zhuǎn)錄酶（Vazyme＃MR201）和未定向改造的逆轉(zhuǎn)錄酶（其余組分與Vazyme ＃MR201一致）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在相同條件下對(duì)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的cDNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)2個(gè)體系?？梢钥吹?，使用Vazyme ＃MR201逆轉(zhuǎn)錄 miRNA后qPCR檢測(cè)得到的熔解曲線單峰且峰形優(yōu)異，特異性更高。


注意事項(xiàng)
1.防止RNase污染：保持實(shí)驗(yàn)區(qū)域潔凈；操作時(shí)需穿戴干凈的手套、口罩；實(shí)驗(yàn)所用的離心管、槍頭等耗材均需保證RNase-free。

2.反應(yīng)液的配制請(qǐng)?jiān)诒喜僮魍瓿伞?/span>

實(shí)驗(yàn)流程

1.在RNase-free離心管中配制如下混合液：

反應(yīng)中使用的Total RNA必須含有miRNA。
用移液器輕輕吹打混勻。

2.按下列條件進(jìn)行第一鏈cDNA合成反應(yīng)：

反應(yīng)得到的cDNA可立即或稀釋后用于熒光定量，對(duì)于高豐度表達(dá)的miRNA，可根據(jù)具體的Cr值，稀釋10~1000倍。
cDNA應(yīng)避免反復(fù)凍融，短期保存建議存放-20°C；長(zhǎng)期保存建議存放-70°C。

3、莖環(huán)法／加尾法miRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR

Vazyme 提供 SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行miRNA定量反應(yīng)的專用預(yù)混液-miRNA Unimodal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme ＃MQ102），可同時(shí)兼容莖環(huán)和加尾逆轉(zhuǎn)產(chǎn)物。

Vazyme ＃MQ102 產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

1.高效實(shí)驗(yàn)：附贈(zèng)U6內(nèi)參上下游引物，配備莖環(huán)通用下游引物及相關(guān)設(shè)計(jì)軟件。

2.高靈敏度：可在pg級(jí)的總RNA中檢測(cè)目的miRNA。

3.強(qiáng)特異性：區(qū)分單堿基的差異，非特異識(shí)別率低于5%。

Vazyme #MQ102 實(shí)驗(yàn)案例--高效實(shí)驗(yàn)

Vazyme #MQ102配備了miRNA 莖環(huán)引物設(shè)計(jì)軟件和配套下游通用莖環(huán)引物，同時(shí)附贈(zèng)人、大鼠、小鼠通用的U6內(nèi)參上下游引物，可在寬廣的定量范圍內(nèi)得到良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Vazyme #MQ102 實(shí)驗(yàn)案例--高靈敏度：

以293T細(xì)胞RNA為模版稀釋6個(gè)梯度（1pg-100ng），用miRNA 1st Stand cDNA Synthesis Kit(by stem-loop)(Vazyme #MR101)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA用Vazyme

＃MQ102 檢測(cè)hsa-miR-21-5p基因表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Vazyme ＃MQ102可在pg級(jí)的總RNA中檢測(cè)目的miRNA,且能在寬廣的定量范圍內(nèi)得到良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Vazyme #MQ102 實(shí)驗(yàn)案例--強(qiáng)特異性：

miRNA序列短，同一家族不同成員序列非常相似，有些僅有單個(gè)堿基差別，因此特異性對(duì)miRNA定量至關(guān)重要。Vazyme ＃MQ102核心酶以雙抗封閉，配以優(yōu)化的Buffer，能夠區(qū)分單堿基的差異，非特異識(shí)別率低于5％，實(shí)現(xiàn)高特異性定量。

莖環(huán)定量引物設(shè)計(jì)

1、正向引物：建議根據(jù)完整miRNA序列除去3'末端6個(gè)堿基的剩余部分作為miRNA正向特異性引物，并將其中的U替換為T。也可使用本司提供的miRNA Design軟件設(shè)計(jì)，軟件和說(shuō)明書請(qǐng)?jiān)凇局Z唯贊-資源支持-實(shí)驗(yàn)工具】處下載。

2、反向引物：：莖環(huán)法的qPCR反向通用引物為莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物中莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列的一部分，所用莖環(huán)序列為GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC；本產(chǎn)品提供用于qPCR檢測(cè)的反向通用引物mQ Primer R，與本公司miRNA Design 軟件設(shè)計(jì)的逆轉(zhuǎn)錄引物配套，無(wú)需另外合成；當(dāng)使用不同的莖環(huán)序列時(shí)，需自行設(shè)計(jì)合成qPCR下游引物。

加尾定量引物設(shè)計(jì)

1．正向引物：

①建議根據(jù)完整miRNA序列設(shè)計(jì)miRNA正向特異性引物，并將其中的U替換為T。

②若根據(jù)miRNA序列設(shè)計(jì)的正向特異性引物退火溫度過(guò)低，建議在引物5'端增加幾個(gè)堿基（以G和C為主），增加堿基后需驗(yàn)證引物特異性，以免造成非特異性擴(kuò)增；若引物退火溫度過(guò)高，建議刪去5'端幾個(gè)堿基。

③對(duì)于miRNA前體等長(zhǎng)片段非特異性擴(kuò)增，建議在正向特異性引物3'端增加1-3個(gè)A堿基。

④對(duì)于序列相似的miRNA，建議正向特異性引物3'端終止于差異堿基，若由于引物長(zhǎng)度過(guò)短而導(dǎo)致退火溫度過(guò)低，可在引物5'端增加幾個(gè)堿基，使上下游引物Tm值匹配。反向

2.2、反向引物：本公司Vazyme ＃MR102中提供用于qPCR檢測(cè)的反向通用引物 Universalreverse Q primer，退火溫度約為66℃，無(wú)需另外合成；當(dāng)使用不同的逆轉(zhuǎn)錄試劑時(shí)，需自行設(shè)計(jì)合成qPCR逆向引物。

·注意事項(xiàng)

1．本品盡量避免反復(fù)凍融，以免造成酶活下降。如每次使用量較少，推薦小份分裝使用。

2．使用前請(qǐng)上下顛倒以混勻Master Mix，請(qǐng)勿vortex避免產(chǎn)生氣泡，影響定量結(jié)果。MasterMix經(jīng)混勻短暫離心后即可使用。

3．由于本品中含有熒光染料SYBR Green1，因此需避光保存，配制反應(yīng)體系時(shí)應(yīng)盡量避免強(qiáng)光照射。

4．由于本品檢測(cè)靈敏度特高，易被空氣中氣溶膠污染。因此反應(yīng)體系配制時(shí)請(qǐng)于超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，配制過(guò)程中請(qǐng)使用滅菌槍頭、反應(yīng)管，條件容許的實(shí)驗(yàn)室推薦使用專用的移液槍和帶濾芯的槍頭。

5．本品中的藍(lán)色染料經(jīng)測(cè)試不影響SYBR GreenI熒光的信號(hào)采集。

·實(shí)驗(yàn)流程

1．在qPCR管中配制如下混合液

莖環(huán)法（相對(duì)定量?jī)?nèi)參體系配制參考右表）

加尾法（相對(duì)定量?jī)?nèi)參體系配制參考右表）

2.按下列條件進(jìn)行qPCR反應(yīng)：

miRNA逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR的常見(jiàn)FAQ
1.miRNA逆轉(zhuǎn)錄的常見(jiàn)FAQ

莖環(huán)法Vazyme＃MR101能否用于加Poly（A）尾法逆轉(zhuǎn)錄？

不能。MR101是通過(guò)莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)miRNA，利用莖環(huán)引物在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下獲得cDNA。而加Poly（A）尾法體系中含有兩個(gè)酶的作用，首先是Poly（A）聚合酶在單鏈RNA的3'端加上一串Poly（A）尾，然后利用體系中的Oligo dT通用型引物在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。MR101中沒(méi)有Poly（A）聚合酶，故不能用于Poly(A)尾法逆轉(zhuǎn)錄。

為什么莖環(huán)法Vazyme #MR101帶基因組清除組分，而加尾法Vazyme #MR201不帶基因組清除組分？
因?yàn)镸R201中的Poly(A)聚合酶（PAP）不能對(duì)基因組DNA進(jìn)行加尾，逆轉(zhuǎn)錄引物無(wú)法識(shí)別基因組DNA，所以MR201中不帶專門基因組清除的組分。

2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的常見(jiàn)FAQ

·miRNA推薦使用的內(nèi)參：

small nucleolar RNA（snoRNA）長(zhǎng)度約為60～300nt左右，在多種組織細(xì)胞中高表達(dá)，不涉及miRNA的調(diào)節(jié)途徑，所以snoRNA是很好的內(nèi)參選擇。研究證實(shí)常用的snoRNAassays 包括：

Human:U6、RNU48、RNU44、U47;

Mouse:U6、snoRNA-202、snoRNA-234、snoRNA-420;

還有一類是在不同實(shí)驗(yàn)條件下變化差異很小的miRNA：

Human/mouse tissues: miR-152、-186、-25、-92、-26b、-16;

Human/mouse cell lines: miR-374、-16、-93、-186、-26b;

還有一類是傳統(tǒng)沿用的18S rRNA or U6。

莖環(huán)法miRNA做逆轉(zhuǎn)、定量時(shí)，內(nèi)參的逆轉(zhuǎn)錄引物和qPCR引物如何設(shè)計(jì)？以常用的U6內(nèi)參為例，U6的序列足夠長(zhǎng)，因此不需要設(shè)計(jì)莖環(huán)引物（當(dāng)內(nèi)參產(chǎn)物長(zhǎng)度在80bp以上時(shí)就不需要設(shè)計(jì)莖環(huán)引物），U6在逆轉(zhuǎn)錄的時(shí)候投入qPCR下游引物即可，可以看作投入逆轉(zhuǎn)錄的特異性引物逆轉(zhuǎn)，后續(xù)qPCR定量的時(shí)候正常投入上下游引物即可。

加尾法miRNA做逆轉(zhuǎn)、定量時(shí)，內(nèi)參的逆轉(zhuǎn)錄引物和qPCR引物如何設(shè)計(jì)？加尾法逆轉(zhuǎn)錄可以對(duì)提取純化的所有mRNA和miRNA進(jìn)行無(wú)差別加尾，因此不需要對(duì)內(nèi)參做單獨(dú)處理。

擴(kuò)增曲線形狀異常？

1．?dāng)U增曲線不光滑：信號(hào)太弱，經(jīng)系統(tǒng)矯正后產(chǎn)生，提高模板濃度重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2．?dāng)U增曲線斷裂或下滑：模板濃度較高，基線的終點(diǎn)值大于C4值。減小基線終點(diǎn)（C1值-4），重新分析數(shù)據(jù)。

3．個(gè)別擴(kuò)增曲線突然驟降：反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡，處理樣本時(shí)要注意離心，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)之前要仔細(xì)檢查反應(yīng)管內(nèi)是否有氣泡殘留。

反應(yīng)結(jié)束無(wú)擴(kuò)增曲線出現(xiàn)？

1．反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般設(shè)置循環(huán)數(shù)為40，但需要注意的是過(guò)多的循環(huán)會(huì)增加過(guò)多的背景信號(hào)，降低數(shù)據(jù)可信度。

2．確認(rèn)程序中是否設(shè)置了信號(hào)采集步驟：兩步法擴(kuò)增程序一般將信號(hào)采集設(shè)置在退火延伸階段；三步法擴(kuò)增程序應(yīng)當(dāng)將信號(hào)采集設(shè)置在72℃延伸階段。

3．確認(rèn)引物是否降解：長(zhǎng)時(shí)間未用的引物應(yīng)先通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)完整性，以排除其降解的可能。

4．模板濃度太低：減少稀釋度重復(fù)實(shí)驗(yàn)，一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起。

5．模板降解：重新制備模板，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

Cr值出現(xiàn)太晚？

1．?dāng)U增效率極低：優(yōu)化反應(yīng)條件，嘗試三步法擴(kuò)增程序，或者重新設(shè)計(jì)合成引物。

2．模板濃度太低：減少稀釋度重復(fù)實(shí)驗(yàn)，一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起。

3．模板降解：重新制備模板，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

4．體系中存在PCR抑制劑：一般為模板帶入，加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

溶解曲線出現(xiàn)多峰？

1．引物設(shè)計(jì)不優(yōu)：根據(jù)設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)合成新的引物；莖環(huán)法可嘗試引物設(shè)計(jì)時(shí)向前延伸幾個(gè)堿基，增加引物特異性。

2．引物濃度太高：適當(dāng)降低引物濃度。

3．cDNA模板帶有基因組污染：重新制備cDNA模板。

·陰性對(duì)照出現(xiàn)明顯擴(kuò)增？

1．反應(yīng)體系污染：更換新的Mix、ddH2O、引物重復(fù)實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系在超凈工作臺(tái)內(nèi)配制，減少氣溶膠污染。

2．引物二聚體的出現(xiàn)：配合熔解曲線進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差？

1．加樣體積失準(zhǔn)：配制反應(yīng)體系時(shí)盡量使用大體積移液配制，同時(shí)使用性能較好的移液槍和低吸附耗材。

2．定量PCR儀不同位置溫度控制不一致：定期校準(zhǔn)儀器。

3．模板濃度太低：模板濃度越低，重復(fù)性越差，減少模板稀釋度或提高加樣體積。

·絕對(duì)定量時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳？

1．稀釋誤差：采用逐級(jí)稀釋法進(jìn)行模板稀釋，配制反應(yīng)體系時(shí)盡量使用大體積移液配制，同時(shí)使用性能較好的移液槍和低吸附耗。
2.系計(jì)算。

3．引物擴(kuò)增效率差：根據(jù)設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)合成新的引物。

4．標(biāo)準(zhǔn)品降解：重新制備標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

安培生物致力成為推動(dòng)生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴的合作者

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