分析方法學(xué)驗(yàn)證中的檢測限和定量限

靈敏度（Sensitivity）是指某方法對(duì)單位濃度或單位量待測物質(zhì)變化所引起的響應(yīng)量變化程度。它可以用儀器的響應(yīng)值或其他指示量與對(duì)應(yīng)的待測物質(zhì)的濃度或量之比來描述。它是分析方法的基本屬性，標(biāo)志著方法的檢出能力，包括了檢測限和定量限。

定義和分類  

檢測限（Limit of Detection，LOD）：系指試樣中被測物能被檢測出的zui低量。檢測限僅作為限度試驗(yàn)指標(biāo)和定性鑒別的依據(jù)，沒有定量意義。因此需要注意的是在檢出限附近不能進(jìn)行準(zhǔn)確的定量，且報(bào)告未檢出時(shí)應(yīng)附上方法的檢測限。

定量限（Limit of Quantitation，LOQ）：系指試樣中被測物能被定量測定的zui低量。對(duì)于微量或痕量藥物分析、定量測定藥物雜質(zhì)和降解產(chǎn)物時(shí)，應(yīng)確定方法的定量限。需要注意的是定量限的測定結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度和精密度要求。同時(shí)定量限的濃度通常應(yīng)小于等于報(bào)告限的濃度，以確保報(bào)告數(shù)值的準(zhǔn)確可靠。

另外需要注意的是：

• 定量限/檢測限有些地方會(huì)翻譯為Quantitation limit，QL和Detection Limit，DL，這個(gè)根據(jù)各個(gè)公司自己規(guī)定執(zhí)行即可。

• 在一些國外的質(zhì)檢報(bào)告（COA）中可能會(huì)出現(xiàn)LOD表示為Loss On Drying（干燥失重）的縮寫，需要注意區(qū)分。

• 本文討論的檢測限均指的是分析方法的檢測限，對(duì)于儀器檢出限和方法檢出限的區(qū)別，我們后面再細(xì)細(xì)討論。

做法和要求    

1）直觀法

用已知濃度的被測物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測出的zui低濃度或量。

如薄層色譜TLC法，通過配制一系列已知濃度的樣品來試驗(yàn)，直至能夠明顯觀察到斑點(diǎn)。

2）基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法

通過多次空白測定和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，分別獲得響應(yīng)值偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來計(jì)算得到zui低濃度。計(jì)算公式為：

如紫外分光光度法，通過配制空白和標(biāo)曲溶液來測試，可分別獲得響應(yīng)值偏差和標(biāo)曲的斜率，然后計(jì)算得到LOD/LOQ。

3）信噪比法

用于能顯示基線噪聲的分析方法（最常見的就是色譜法），把已知低濃度試樣測出的信號(hào)與空白樣品測出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠地檢測出的被測物質(zhì)zui低濃度或量。

一般以信噪比為 3 : 1 時(shí)相應(yīng)濃度或量確定檢測限， 10：1時(shí)的量為定量限。

此處延伸一點(diǎn)就是信噪比計(jì)算中，噪音（Noise）常見的三種不同計(jì)算方式：

• 漂移線性回歸校準(zhǔn)偏差SD 的六倍的噪聲（6*SD）

• 峰峰漂移修正間的噪聲（PtoP）

• 用ASTM 方法檢測的噪聲 (ASTM)

4）基于精密度和準(zhǔn)確度的特定濃度

ICH Q2（R2）在原先幾種方法的基礎(chǔ)上提出了一個(gè)新的方法---基于準(zhǔn)確度和精密度的方法下限。

（注：ICH Q2中提出了方法的工作范圍Working Range這個(gè)概念，并將線性和定量限/檢測限合并了，其中下限lower range limit即可理解為方法的定量限和檢測限。）

看原文：

4.2.2.3 Based on Accuracy and Precision at lower range limits

Instead of using estimated values as described in the previous approaches, the QL can be directly validated by accuracy and precision measurements.

不同于原先方法的估算濃度，定量限可以直接通過驗(yàn)證方法的精密度和準(zhǔn)確度來設(shè)定。

然后在此項(xiàng)的數(shù)據(jù)要求中，有這樣一段描述：

Also, the QL and the approach used for its determination should be presented.

相同的，定量限的濃度以及測定方法是需要明確指出來的。

If the QL was estimated, the limit should be subsequently validated by the analysis of a suitable  number of samples known to be near or at the QL. In cases where the QL is well below (e.g., approximately 10 times lower than) the reporting limit, this confirmatory validation can be omitted with justification.

如果定量限是估算出來的，那么這個(gè)限度濃度應(yīng)該使用一系列已知的并且在定量限附近濃度的樣品來確認(rèn)的。如果定量限遠(yuǎn)小于報(bào)告限（如1/10或更低），那么它是可以不像前面的做法來做確認(rèn)的，進(jìn)行解釋說明即可。

For impurity tests, the quantitation limit for the analytical procedure should be equal to or below the reporting threshold.

對(duì)于雜質(zhì)測定來說，分析方法的定量限應(yīng)小于或等于報(bào)告限。

對(duì)此，個(gè)人理解ICH在傳遞的信息是：方法的靈敏度滿足使用需求即可（類似于Q3A中指出報(bào)告限的作用）。我們無需去證明方法的靈敏度有多高，只需要保證我們設(shè)定的特定限度滿足方法準(zhǔn)確定量的要求即可。

隨著這個(gè)觀點(diǎn)的轉(zhuǎn)變，將使得LOD/LOQ從一個(gè)未知的濃度（需要估算或一系列實(shí)驗(yàn)來摸索測定）變成了一個(gè)已知的濃度（特定的滿足使用要求的濃度），從解題變成了證明題，使得大家一下子變得輕松了許多。

實(shí)際上這個(gè)觀點(diǎn)，在國內(nèi)很多人已經(jīng)提出過并且也在被越來越多的人接受。原因就是在原先的要求下（既要滿足信噪比要求，又要滿足精密度和準(zhǔn)確度要求），一方面兩者很難兼得，為達(dá)到要求往往需要耗費(fèi)較多的精力；另一方面不同人員、不同儀器、不同時(shí)間、不同實(shí)驗(yàn)室很難得出一個(gè)相同的濃度。因此大家在進(jìn)行靈敏度驗(yàn)證的時(shí)候就會(huì)變得非常糾結(jié)和痛苦。

采用這個(gè)新理念在具體的方法驗(yàn)證過程中，對(duì)于定量限的驗(yàn)證，需要做的就是選擇一個(gè)特定的濃度（通常以報(bào)告限為基礎(chǔ)，結(jié)合實(shí)際的控制限度，如報(bào)告限的一半或更低），然后用精密度和準(zhǔn)確度的做法來驗(yàn)證選定的定量限的這個(gè)濃度點(diǎn)。

文章最后，我們還需要再強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)就是：定量限是要保證精密度和準(zhǔn)確度的！

因此定量限下的準(zhǔn)確度和精密度是需要驗(yàn)證的，驗(yàn)證的可接受標(biāo)準(zhǔn)是不可以獨(dú)自放寬的。