賴(lài)氨酸(lysine，Lys)含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100 管/96 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

賴(lài)氨酸是人體必需氨基酸之一，能促進(jìn)人體發(fā)育、增強(qiáng)免疫功能，并有提高中樞神經(jīng)組織功能的作用。賴(lài)氨酸為堿性必需氨基酸。由于谷物食品中的賴(lài)氨酸含量甚低，且在加工過(guò)程中易被破壞而缺乏，故稱(chēng)為第一限制性氨基酸。

測(cè)定原理：

蛋白質(zhì)中的賴(lài)氨酸具有一個(gè)游離的ε-NH2，它與茚三酮試劑反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)，其顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與賴(lài)氨酸的含量成線性關(guān)系。亮氨酸與賴(lài)氨酸的碳原子數(shù)目相同，而且僅有—個(gè)游離氨基(ε-NH2)，所以通常用亮氨酸配制標(biāo)準(zhǔn)液。

組成：

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰、蒸餾水、水浴鍋。

賴(lài)氨酸提取：

樣本烘干粉碎，稱(chēng)取約 0.01g 樣本，加入 1ml 提取液，充分勻漿。80℃水浴提取 20min，冷卻后 10000g

離心 10min，取上清待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 570nm，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液的配制：取 10ml 試劑一與 10ml 試劑二混合搖勻，取上清備用。用不完的試劑 4℃保存。

3、在有蓋EP 管中加入下列試劑：

混勻，80℃水浴 30min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻至常溫。

混勻，取 200μl 至微量石英比色皿或 96 孔板中，于 530nm 波長(zhǎng)處記錄吸光值A。△A=A 測(cè)定管-A 空白管?？瞻坠苤灰鲆还?。

賴(lài)氨酸含量計(jì)算：

a.  用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 0.0062x - 0.0212；x 為賴(lài)氨酸含量（µg/ml），y 為吸光值。

1.  按照蛋白濃度計(jì)算

賴(lài)氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.0212)÷0.0062×V1]÷(Cpr ×V1)×1.1515

=185.73×(△A+0.0212) ÷Cpr

2.  按照樣本質(zhì)量計(jì)算

賴(lài)氨酸含量(µg/g 干重)=[(△A +0.0212)÷0.0062×V1]÷(W ×V1÷V2)×1.1515

=185.73×(△A+0.0212) ÷W

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1ml；V2：加入提取液體積，1 ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml； W：樣本質(zhì)量，g；1.1515，校正系數(shù)。

b.  用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 0.0031x - 0.0212；x 為賴(lài)氨酸含量（µg/ml），y 為吸光值。

1.  按照蛋白濃度計(jì)算

賴(lài)氨酸含量(µg/mg prot)=[(△A +0.0212)÷0.0031×V1]÷(Cpr ×V1)×1.1515

=371.45×(△A+0.0212) ÷Cpr

2.  按照樣本質(zhì)量計(jì)算

賴(lài)氨酸含量(µg/g 干重)= [(△A +0.0212)÷0.0031×V1]÷(W ×V1÷V2)×1.1515

=371.45×(△A+0.0212) ÷W

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1ml；V2：加入提取液體積，1 ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml； W：樣本質(zhì)量，g；1.1515，校正系數(shù)。