實時熒光定量PCR 方法原理簡述

        目前主流的實時熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）方法分為染料法和探針法，染料法以SYBR Green法為代表，SYBR Green染料游離時熒光微弱，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強，反應管中的熒光強度與反應管中雙鏈DNA的數(shù)量成正比例關系，因此可以通過檢測熒光計算反應管中產(chǎn)生的雙鏈DNA（PCR產(chǎn)物）的量，但該方法沒有特異性，非特異性擴增的產(chǎn)物也會被計入。對于探針法來說，反應管中的熒光強度也是檢測PCR產(chǎn)物量的依據(jù)。但其發(fā)光機制卻與染料法全不同。

      根據(jù)所使用的技術不同，實時熒光定量PCR可以分為：熒光探針和熒光染料兩種方法?，F(xiàn)將其原理簡述如下：

 1. TaqMan熒光探針

    TaqMan探針法是高度特異的定量PCR技術，其核心是利用Taq酶的3'→5'外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的3'→5'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成wan全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的shou選技術平臺。

2. SYBR熒光染料

    在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加wan全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應是否特異。SYBR熒光染料法定量PCR的基本過程是：

    ① 開始反應，當SYBR染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光；

    ② DNA變性時，SYBR染料釋放出來，熒光急劇減少；

    ③ 在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR引物；

    ④ 聚合完成后，SYBR染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。

    實時熒光定量PCR技術根據(jù)化學原理可以分為探針類和非探針類。探針類實時熒光定量 PCR 技術主要是利用與靶序列特異雜 交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加；非探針類實時熒光定量 PCR 技 術主要通過熒光染料來指示產(chǎn)物的增加。無論是探針類實時熒光 定量 PCR 技術還是非探針類實時熒光定量 PCR 技術，檢測的都是 擴增產(chǎn)物的增加量。但探針類實時熒光定量 PCR 技術增加了識別 探針的具體的流程，操作的難度較大。