質(zhì)粒提取常見問題案例梳理，助您實(shí)驗(yàn)！

如圖所示，質(zhì)粒提取之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)明顯的RNA條帶，說明有RNA污染。

原因及解決方法：

（1）未在緩沖液 RS*中事先加入RNase A。解決方法：補(bǔ)加RNase A。

（2）加入RNase A的緩沖液 RS*長期保存于室溫，導(dǎo)致RNase A活性下降。解決方法：每次使用后置于 4℃保存。若長期不用，置于-20℃保存。

（3）細(xì)菌過量,RNase A不能有效降解RNA。解決方法：將細(xì)菌用量減半或增加RNase A在緩沖液 RS*中的濃度。

（1）菌體裂解和中和過程中,劇烈混合造成基因組DNA斷裂所致。解決方法：溫和地進(jìn)行菌體的裂解和中和。

（2）加裂解液 LB時(shí)操作時(shí)間過長，造成基因組DNA斷裂所致。解決方法：將裂解步驟控制在5分鐘內(nèi)完成。

（3）細(xì)菌的質(zhì)量差（反復(fù)凍融的細(xì)菌，陳舊的細(xì)菌，培養(yǎng)條件不合適的細(xì)菌等）中有許多斷裂或降解而游離的基因組DNA，使用生長良好的新鮮細(xì)菌。

如圖右所示，質(zhì)粒提取之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，開環(huán)質(zhì)粒的占比約20%，說明超螺旋比例低，一般超螺旋比例需要＞90%，一般來說超螺旋比例越高，質(zhì)粒的穩(wěn)定性越高，高超螺旋比例的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染效率、基因表達(dá)水平等方面具有更好的表現(xiàn)。

原因：裂解時(shí)間不宜過長，加入裂解液后裂解時(shí)間不應(yīng)超過5分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞

解決方法：優(yōu)化裂解時(shí)間；確保質(zhì)粒的結(jié)合和所有溶液都在室溫下進(jìn)行，減少離心力對質(zhì)粒超螺旋結(jié)構(gòu)的影響，因?yàn)檫^度的離心可能會破壞質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)。

常規(guī)質(zhì)粒DNA純化中，質(zhì)粒DNA仍需要從55%蛋白質(zhì)、20%RNA、3%內(nèi)毒素和3%基因組DNA中分離，在質(zhì)粒DNA制備的菌體裂解過程中，內(nèi)毒素分子被釋放到溶菌液中。由于內(nèi)毒素常形成囊狀結(jié)構(gòu)，其分子量、電荷性和疏水性都與質(zhì)粒DNA相似，常用的純化方法很難將內(nèi)毒素與質(zhì)粒DNA分開。內(nèi)毒素會降低原代細(xì)胞和敏感培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，干擾免疫細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染。由于實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，對質(zhì)粒DNA的內(nèi)毒素要求亦不同，尤其是在細(xì)胞轉(zhuǎn)染、基因沉默研究、基因治療等過程中，對質(zhì)粒質(zhì)量、內(nèi)毒素水平要求更為苛刻，對于非敏感型的的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，要求內(nèi)毒素殘留0.1～2.5 EU/ug，對于敏感型的的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，要求內(nèi)毒素殘留＜0.1 EU/ug。

原因：內(nèi)毒素去除時(shí)操作不當(dāng)或者未選擇合適的試劑

解決方法：

（1）如果采用的內(nèi)毒素清除的方法，離心之后，上層水相含DNA，下層藍(lán)色油狀相含內(nèi)毒素和其它雜質(zhì)。這時(shí)注意不要吸到藍(lán)色油狀層，里面含內(nèi)毒素等雜質(zhì)。

（2）在使用樹脂純化系統(tǒng)去除內(nèi)毒素時(shí)，需要先活化樹脂，然后使用平衡緩沖液平衡樹脂，以確保最佳的去除效率。