明星膜蛋白CLDN 18.1新合成路線：無細(xì)胞系統(tǒng)全長蛋白表達(dá)

緊密連接蛋白（Claudin）是細(xì)胞間粘附蛋白，在緊密連接（Tight junction）中表達(dá)。Claudin有助于調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的防御和屏障功能以及分化和極性。在化學(xué)結(jié)構(gòu)上Claudin 家族具有高度同源性，均由4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞內(nèi)N和C末端以及2個(gè)細(xì)胞外環(huán)組成^[1]。

CLDN 18是Claudin蛋白家族的成員，其有CLDN 18.1 和CLDN 18.2 兩種異構(gòu)體。其中，CLDN 18.1是肺上皮特異性緊密連接蛋白，僅在正常肺泡組織中過表達(dá)；Claudin 18.2 僅在正常胃上皮細(xì)胞和十二指腸潘氏細(xì)胞表達(dá)，在其他器官如食道、結(jié)腸、胰腺和肺中不表達(dá)^[2]。目前，已有一系列研究報(bào)道了癌癥中Claudin的表達(dá)失調(diào)，Claudin可能成為提高癌癥治療效果的新靶點(diǎn)。

圖1 Claudin 蛋白結(jié)構(gòu)示意圖^[1]

近日，珀羅汀生物通過無細(xì)胞蛋白表達(dá)平臺，成功實(shí)現(xiàn)了全長CLDN 18.1膜蛋白可溶表達(dá)，且具有生物學(xué)活性！

實(shí)驗(yàn)人員首先構(gòu)建了融合標(biāo)簽的CLDN 18.1質(zhì)粒，隨后選用多種珀羅汀無細(xì)胞表達(dá)條件體系，進(jìn)行表達(dá)測試。如圖2、圖3所示，CLDN 18.1在不添加表面活性劑的無細(xì)胞體系中主要表達(dá)在沉淀中；通過在無細(xì)胞反應(yīng)體系中加入表面活性劑，CLDN 18.1即實(shí)現(xiàn)可溶表達(dá)。經(jīng)純化，成功獲得80%以上純度的CLDN 18.1蛋白。下游活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，CLDN 18.1蛋白具有良好的生物學(xué)活性！

圖2 CLDN 18.1在珀羅汀無細(xì)胞體系表達(dá)后SDS-PAGE

（S為上清樣，P為沉淀樣）

圖3 CLDN 18.1在珀羅汀無細(xì)胞體系表達(dá)并經(jīng)Ni珠親和純化后SDS-PAGE（E為洗脫樣）

珀羅汀無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)(Cell Free Protein Synthesis, CFPS)通過在無細(xì)胞反應(yīng)體系中加入表面活性劑或納米盤的方式，為膜蛋白提供類膜結(jié)構(gòu)，從而保持膜蛋白的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)膜蛋白在上清中可溶表達(dá)，且接近天然構(gòu)象。

珀羅汀無細(xì)胞膜蛋白表達(dá)平臺優(yōu)勢：

1. 能夠解決膜蛋白構(gòu)象不穩(wěn)定、易于形成包涵體、難分離純化等難題，且所表達(dá)膜蛋白具有生物學(xué)活性；

2. 全長膜蛋白表達(dá)，無截?cái)嗖僮鳎?/p>

3. 無需去垢劑溶膜步驟，操作更加簡便；

4. 反應(yīng)體系可以線性化放大，從50微升到升級別。

目前，珀羅汀CFPS膜蛋白表達(dá)成功率接近100%，已成功表達(dá)多種單次、四次、七次跨膜蛋白。