微生物細(xì)菌學(xué)檢查的分離培養(yǎng)與接種實(shí)驗(yàn)方法！

一、細(xì)菌的分離培養(yǎng)

1、培養(yǎng)基制作的原則和一般步驟

（1）培養(yǎng)基制作的原則  培養(yǎng)基是人工方法將多種物質(zhì)按照各類微生物生長(zhǎng)的需要而合成的一種混合營(yíng)養(yǎng)料，一般用以分離和培養(yǎng)菌類。常用的培養(yǎng)基有基礎(chǔ)培養(yǎng)基、增菌培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基等。在制作培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)掌握如下原則和要求：

①培養(yǎng)基必須含有細(xì)菌生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

②必須滅菌,不得含有任何活細(xì)菌。

③培養(yǎng)基的材料和盛培養(yǎng)基的容器上,沒有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的物質(zhì)。

④所制備培養(yǎng)基應(yīng)該是透明的，以便觀察細(xì)菌生長(zhǎng)性狀和其它代謝活動(dòng)所產(chǎn)生的變化。

⑤培養(yǎng)基的酸堿度應(yīng)該符合細(xì)菌的生長(zhǎng)要求，多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)適宜范圍是弱堿（pH7.1~7.6）。

（2）培養(yǎng)基制備的一般過程  不同的培養(yǎng)基其制備方法不同，一般要經(jīng)如下步驟：

①根據(jù)不同的菌類和用途，選擇適宜的培養(yǎng)基。

②精確稱量各種成分。

③將各種成分按規(guī)定加熱溶解，調(diào)整pH到適宜的范圍內(nèi)。再加熱煮沸10~15分鐘（注意補(bǔ)加液體的損耗）

④過濾（用濾袋或紗布棉花），分裝、滅菌（不同的培養(yǎng)基的滅菌溫度和時(shí)間不同，通常為15磅壓力下15~30分鐘）

⑤培養(yǎng)基中的某些成分，象血清、腹水、糖類、尿素、氨基酸、酶等，在高溫下易分解，變性，故應(yīng)用濾菌器過濾，再按規(guī)定的溫度和量加入培養(yǎng)基中。

⑥無菌檢驗(yàn)，取作好的培養(yǎng)基數(shù)管，置37℃恒溫箱內(nèi)24小時(shí)，若無細(xì)菌和霉菌生長(zhǎng)即可使用。

2、細(xì)菌的分離培養(yǎng)

在細(xì)菌學(xué)診斷中，細(xì)菌的分離培養(yǎng)是的一環(huán)，分離培養(yǎng)的目的是在病料中由多種細(xì)菌里挑選出可疑菌。在分離培養(yǎng)之前，首先應(yīng)該注意下列事項(xiàng)：

（1）選擇適合于所含分離細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。

（2）培養(yǎng)溫度一般在37℃，但應(yīng)考慮特殊細(xì)菌對(duì)溫度的要求。

（3）考慮所分離的細(xì)菌是需氧性或厭氧性，進(jìn)一步?jīng)Q定培養(yǎng)條件。

（4）初步分離時(shí)發(fā)現(xiàn)有多種細(xì)菌，應(yīng)進(jìn)一步選擇可疑菌落進(jìn)行純培養(yǎng)

二、細(xì)菌的接種

1、平板劃線法  此法為常用的細(xì)菌分離培養(yǎng)法。平板劃線培養(yǎng)的方法甚多，可按各人的習(xí)慣選擇應(yīng)用，其目的都是將被檢材料作適當(dāng)?shù)南♂?，以求獲得獨(dú)立單在的菌落，防止發(fā)育成菌苔，以致不易鑒別其菌落性狀。劃線培養(yǎng)時(shí)須注意以下幾點(diǎn)：

（1）左手持皿，用左手拇指，食指及中指將皿蓋揭開成20度左右的角度（角度愈小愈好，以免空氣中的細(xì)菌進(jìn)入皿中將培養(yǎng)基污染）。

（2）右手持接種環(huán)，將材料少許涂布于培養(yǎng)基邊緣，然后將接種環(huán)上多余的材料在火焰中燒毀，待接種環(huán)冷卻后，再與涂材料之處輕輕接觸，開始劃線。

（3）劃線時(shí)先將接種環(huán)稍稍彎曲，這易和平皿內(nèi)瓊脂平行，不致劃破培養(yǎng)基。

（4）劃線中不宜過多地重復(fù)舊線，以免形成菌苔。

（5）平皿蓋向下，在培養(yǎng)皿上標(biāo)注樣品名稱、編號(hào)、接種日期后，置溫箱中培養(yǎng)。

2、斜面接種法

3、液體培養(yǎng)基接種法

三、細(xì)菌培養(yǎng)性狀觀察

1、細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)性狀觀察

（1）渾濁度  觀察是否透明，輕度渾濁，中度渾濁或極度渾濁，還有均勻渾濁，顆粒狀渾濁，絮狀渾濁。

（2）沉淀  試管底有無沉淀，沉淀物呈顆粒狀，粘稠狀或絮狀。輕搖時(shí)云霧狀，絮狀或發(fā)辮狀開起。

（3）表面  有無菌膜及附著于管壁的菌環(huán)。

（4）色素及氣味

2、細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)性狀觀察

（1）大小  各種細(xì)菌菌落大小差異很大，菌落直徑在1毫米以下為露滴狀菌落；1~2毫米為小菌落；2~4毫米為中等大菌落；4~6毫米或更大為大菌落。

（2）形狀  有圓形、規(guī)則形、根足形、菌絲狀等。

（3）邊緣  有整齊、鋸齒狀、纖毛狀、卷發(fā)狀等。

（4）表面  有光滑、濕滑、粗糙、顆粒狀、皺絲狀、同心狀、放射狀等。

（5）降起度  有角平、隆起、臍狀、扭扣狀。

（6）顏色  有無色、白色、灰白色、金黃色、檸檬色、綠色、紅色等。

（7）透明度 有透明、半透明、不透明等。

四、顯微鏡檢查——細(xì)菌抹片制備、染色及鏡檢

細(xì)菌細(xì)胞微小，無色而半透明，原樣直接在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，只能大致見到其外貌，制成抹片和染色之后，則能較清楚地顯示其形態(tài)和特殊構(gòu)造，也可以根據(jù)不同的染色反應(yīng)，作為鑒別細(xì)菌的一種依據(jù)。

常應(yīng)用各種染料對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，由于毛細(xì)管、滲透、吸附和吸收等物理作用，以及離子交換，酸堿等化學(xué)作用，染料就能使細(xì)菌著色，且因細(xì)菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分不同，而含有不同的染色反應(yīng)。

1、細(xì)菌抹片的制備

進(jìn)行細(xì)菌染色之前，須先作好細(xì)菌抹片，其方法如下：

（1）玻片準(zhǔn)備  載玻片應(yīng)清晰透明、潔凈而無油漬，滴上水后，能均勻展開，附著性好。如有油漬，可按下列方法處理：

①滴上95%酒精2~3滴，用潔凈紗布揩擦，然后在酒精燈火焰上輕輕拖過幾次。

②若上法仍未能去除油漬，可再滴上1~2滴冰醋酸，用紗布擦凈，再在酒精燈火焰上輕輕通過。

（2）抹片  所用材料情況不同，抹片方法亦有差異。

液體材料（如液體培養(yǎng)物、血液、滲出液、乳汁等）可直接用滅菌接種環(huán)取一環(huán)材料，于玻片的均勻地涂布成適當(dāng)大小的薄層。

不是液體材料（如菌落、膿、糞便等）則應(yīng)先用滅菌接種環(huán)取少量生理鹽水或蒸餾水，置于玻片，然后再用滅菌接種環(huán)取少量材料，在液滴中混合，均勻涂布成適當(dāng)大小的薄層。

組織臟器材料，先用鑷子夾持局部，然后以滅菌或潔凈剪刀取一小塊，夾出后將其新鮮切面在玻片上壓積或涂抹成一薄片。

如有多個(gè)樣品同時(shí)需要制成抹片，只要染色方法相同，亦可以在同一張玻片上有秩序地排好，作多點(diǎn)涂抹，或者先用蠟筆在玻片上劃分成若干小方格，每方格涂抹一種樣品，需要保留標(biāo)本片，應(yīng)貼標(biāo)簽，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。

（3）干燥  上述涂片，應(yīng)讓其自然干燥。

（4）固定  有兩類固定方法。

①火焰固定  將干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精燈火焰上來回通過數(shù)次，略作加熱（但不能太熱，以不燙手背為度）進(jìn)行固定。

②化學(xué)固定  血液、組織臟器等抹片要作姬姆薩（Giemsa）染色，不用火焰固定，而應(yīng)用甲醇固定，可將已干燥的抹片浸入甲醇中2~3 分鐘，取出晾干；或者在抹片上滴加數(shù)滴甲醇使其作用2~3分鐘后，自然揮發(fā)干燥。抹片如作瑞特氏染色（Wright’s stain），則必先須作特別固定，染料中含有甲醇，可以達(dá)到固定的目的。

將抹片固定的目的有如下幾種：

①除去抹片的水分，涂抹材料能很好地貼附玻片，以免水洗時(shí)易被沖掉

②使抹片易于著色或更好地著色，因?yàn)樗赖牡鞍踪|(zhì)比活的蛋白質(zhì)著色力較強(qiáng)。

③可能殺死抹片中的微生物。

必須注意：在抹片固定過程中，實(shí)際上并不能保證殺死全部細(xì)菌，也不能避免在染色水洗時(shí)不將部分抹片沖脫。因此，在制備烈性病原菌，特別是帶芽孢的病原菌的染色抹片時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格慎重處理染色用過殘液和抹片本身，以免引起病原的散播。

固定好的抹片，即可進(jìn)行各種方法的染色。

2、幾種常用染色方法

常用的細(xì)菌染色方法，主要有兩種類型：

（1）簡(jiǎn)單染色法  只應(yīng)用一種染料進(jìn)行染色的方法，如美藍(lán)染色法。

（2）復(fù)染色法   應(yīng)用兩種或兩種以上的染料或再加媒染劑進(jìn)行染色的方法。染色時(shí)，有些是將染料分別先后使用，有些則同時(shí)混合使用。染色后不同的細(xì)菌和物體，或者細(xì)菌構(gòu)造的不同部分可以呈現(xiàn)不同的顏色，有鑒別細(xì)菌的作用，又可稱為鑒別染色，如革蘭氏染色法、抗酸性染色法、瑞特氏染色法和姬姆薩染色法。

①美藍(lán)染色法  在已干燥、固定好的抹片上，滴加適量的（足夠覆蓋涂抹點(diǎn)即可）美藍(lán)染色液，經(jīng)1~3分鐘，水洗，干燥（可用吸水紙吸干，或自然干燥，但不能烤干），鏡檢。

②革蘭氏染色法

A．在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，經(jīng)1~2 分鐘，水洗。

B．加革蘭氏碘溶液于抹片上媒染，作用1~2 分鐘，水洗。

C．加95%酒精于抹片上脫色，約0.5~1 分鐘，水洗。

D．加稀釋石炭酸復(fù)紅（或沙黃水溶液）復(fù)染10~30秒，水洗。

E．吸干或自然干燥，鏡檢。革蘭氏陽性菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

③ 抗酸染色法

A．萋一尼（Ziehl-Neelsen）氏抗酸染色法  首先在已干燥、固定好的抹片上，滴加較多量的石炭酸復(fù)紅染色液，在玻片下以酒精燈火焰微微加熱至發(fā)生蒸氣為度（不要煮沸），維持微微發(fā)生蒸氣，經(jīng)3~5分鐘，水洗。然后用3%鹽酸酒精脫色，至標(biāo)本紅色脫出為止，充分水洗。再用堿性美蘭染色液復(fù)染約1分鐘，水洗。最后吸干，鏡檢。抗酸性細(xì)菌呈紅色，非抗酸細(xì)菌呈藍(lán)色。

B．又法之一：將固定后的抹片滴加金（Kinyoun）氏石炭酸復(fù)紅液，歷3 分鐘。此液配法為：

堿性復(fù)紅              4克        95%乙醇        20毫升

石炭酸（化學(xué)純）     9毫升        蒸餾水        100毫升

溶堿性復(fù)紅于酒精，再緩緩加水并搖振，再加入石炭酸混合。

連續(xù)水洗1.5分鐘后滴加加鮑脫（Gabbott）氏復(fù)染液歷1分鐘。此液配法為：

美藍(lán)             4克           無水乙醇          20毫升

濃硫酸         20毫升            蒸餾水           50毫升

先將美藍(lán)溶于乙醇，再加蒸餾水，再加硫酸。

連續(xù)水洗1 分鐘，吸干，鏡檢?？顾峋始t色，其他菌呈藍(lán)色。

C.又法之二：滴加石炭酸復(fù)紅液于抹片（已干燥固定過的）上染1 分鐘；水洗；再用1%美藍(lán)酒精溶液復(fù)染20秒；水洗，干燥，鏡檢?？顾峋t色。

鏡檢前對(duì)光檢查染色片，標(biāo)本片務(wù)必全呈藍(lán)色。如標(biāo)本片呈現(xiàn)紅色或棕色，表示復(fù)染不足，應(yīng)再作復(fù)染5~10 秒，再觀察。如仍未全呈藍(lán)色時(shí)，仍可反復(fù)復(fù)染，至符合要求為止。

④ 瑞氏染色法

方法一：抹片自然干燥后，滴加瑞特氏染色液于其上，為了避免很快變干，染色液可稍多加些，或者看情況補(bǔ)充滴加，經(jīng)1~3分鐘，再加約與染液等量的中性蒸餾水或緩沖液，輕輕晃動(dòng)玻片，使與染液混勻，經(jīng)5分鐘左右，直接用水沖洗（不可先將染液傾去），吸干或烘干，鏡檢。細(xì)菌染成藍(lán)色，組織、細(xì)胞等物呈其他顏色。

方法二：抹片自然干燥后，按涂抹點(diǎn)大小，蓋上一塊略大的清潔濾紙片，在其上輕輕滴加染色液，至略浸過濾紙，并看情況補(bǔ)滴，維持不使變干；染色3~5分鐘鐘，直接以水沖洗，吸干或烘干，鏡檢。此法的染色液經(jīng)濾紙濾過，可大大避免沉渣粘附抹片上而影響鏡檢觀察。

⑤ 姬姆薩氏染色法

A.于5毫升新煮過的中性蒸餾水中滴加5~10滴姬姆薩染色液原液，即稀釋成 常用的姬姆薩染色液。

B.抹片經(jīng)甲醇固定并干燥后，在其上滴加足量染色液或?qū)⒛ㄆ胧⒂腥旧旱娜旧字?，染?0分鐘，或者染色數(shù)小時(shí)至24小時(shí)，取出水洗，吸干或烘干，鏡檢。細(xì)菌呈藍(lán)青色，組織、細(xì)胞等呈其他顏色，視野常呈紅色。

3、細(xì)菌基本形態(tài)及構(gòu)造的觀察

（1）細(xì)菌的形態(tài)

①球菌：

雙球菌：注意其成雙的排列，兩個(gè)菌體接觸面的形狀以及菌體的形態(tài)。

鏈球菌：注意其鏈狀排列，鏈的長(zhǎng)短，個(gè)體的形態(tài)。

四聯(lián)球菌：注意其四個(gè)聯(lián)結(jié)成方形排列的形態(tài)。

八疊球菌：注意其八個(gè)堆疊一起，呈立體方形的形態(tài)。

葡萄球菌：注意其無一定次序，無一定數(shù)目，不規(guī)則地堆在一起的形態(tài)。

②桿菌：

單桿菌：注意其單個(gè)散在的狀態(tài)，菌體外形、大小、菌端的形狀。

雙桿菌：注意其成雙的排列以及菌體外形、大小、菌端的形狀。

鏈桿菌：注意其成鏈狀排列，鏈的長(zhǎng)短，菌體外形、大小、菌端的形狀。

③螺旋狀菌：

弧菌：注意其彎曲成弧形以及菌體大小，菌端的形狀。

螺菌：注意其具有兩個(gè)彎曲以上的螺旋狀及菌體的長(zhǎng)度、大小，菌端的形狀。

（2）細(xì)菌的一些構(gòu)造

①莢膜：注意莢膜的位置、形狀、大小、染色及相互間的聯(lián)結(jié)。

②鞭毛：注意鞭毛的形狀、長(zhǎng)度、大小、數(shù)目及其在菌體上的排列（單毛、叢毛、周毛）。

③芽孢：注意芽孢的形狀，與菌體相比的大小以及在菌體中的位置（偏端、末端）。

④異染顆粒：注意其與菌體不同的染色反應(yīng)、形狀、大小、多少、位置等。

五、動(dòng)物試驗(yàn)

為了作細(xì)菌或其它微生物的分離鑒定，致病力測(cè)定等，常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行接種，常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種方法有下列數(shù)種。

1、皮下接種

（1）家兔皮下接種  由助手把兔伏臥或仰臥保定，于其背側(cè)或腹側(cè)皮下結(jié)締組織疏松部分剪毛消毒，術(shù)者右手持注射器，以左手拇指、指食和中指捏起皮膚使成一個(gè)三角形皺褶，于其底部進(jìn)針，感到針頭可隨意撥動(dòng)即表示插入皮下。當(dāng)壓入注射物時(shí)感到流利暢通也表示在皮下。拔出注射針頭時(shí)用消毒棉球壓住針孔并稍加按摩。

（2）豚鼠皮下接種  保定和術(shù)式同家兔。

（3）小白鼠皮下注射  作小白鼠皮下注射接種無須助手幫助保定。術(shù)者在做好接種準(zhǔn)備后，以右手捏取鼠尾，此時(shí)鼠頭會(huì)向前掙扎而可以緊牽其尾，然后用左手的拇指和食指捏住其兩耳及其頭頸部皮膚使其翻轉(zhuǎn)，背部皮膚固定于左手中指、無名指及拇指基部之間，以小指壓住其尾根，小白鼠即仰臥保定于左手上。右手操作局部消毒，把持注射器，以針頭稍微挑起皮膚插入皮下，注入時(shí)見有水泡微微鼓起即表示注入皮下。拔出針頭后，同家兔皮下注射時(shí)一樣處理。

2、皮內(nèi)接種  作家兔、豚鼠及小白鼠的皮內(nèi)接種時(shí)，均需助手保定動(dòng)物，其保定方法與皮下接種相同。接種時(shí)術(shù)者以左手拇指及食指夾起皮膚，右手持注射器，針頭要很細(xì)，針頭插入拇指與食指之間的皮膚內(nèi)，針頭插入不宜過深，同時(shí)針頭插入角度要小，即與夾起的皮膚平行，注射時(shí)感到有阻力且注射完畢后皮膚上有小硬皰即為注入皮內(nèi)的表現(xiàn)。皮內(nèi)接種要慢，否則容易使皮膚脹裂或自針孔流出注射物而散播傳染。

3、腹腔內(nèi)接種  在家兔、豚鼠及小白鼠的腹腔接種，宜采取仰臥保定。接種時(shí)其后軀應(yīng)稍抬高使其內(nèi)臟傾向前腔，接種部位在腹后側(cè)面，針頭先插入皮下，后進(jìn)入腹腔，注射后皮膚應(yīng)無皰隆起。其余術(shù)式同于皮下接種法。

4、靜脈注射

（1）家兔的靜脈注射  將家兔納入保定器內(nèi)或由助手保定兔體露出其頭。選一側(cè)耳邊緣靜脈，助手以拇指及食指緊壓耳根部，使靜脈努張，術(shù)者剪去靜脈管上皮膚的毛，消毒局部，若需對(duì)同一動(dòng)物作多次接種時(shí)，應(yīng)自接近耳尖初處開始刺入接種，以后逐次接近耳根。接種時(shí)術(shù)者左手執(zhí)兔耳，右手持針（針頭不宜太細(xì)），以與靜脈平行方向刺入靜脈，同時(shí)助手放松其緊壓手指，以便血液流通。注射時(shí)無阻力且有血向前流即表示注入靜脈。緩緩注射，注射完針頭拔出后，用消毒棉球緊壓針孔片刻，以免流血或注射物溢出。

（2）豚鼠靜脈內(nèi)接種  豚鼠靜脈內(nèi)接種比較困難，因?yàn)殡嗍鬀]有裸露明顯的靜脈可尋，若必須作注射時(shí)，使豚鼠伏臥保定，腹面向下，將其后肢剃毛，用70%酒精消毒皮膚，施以全身麻醉，用銳利刀片向后肢內(nèi)上側(cè)向外下方切一長(zhǎng)約一厘米的切口，使露出皮下靜脈，用最小號(hào)針頭（26號(hào)），刺入靜脈慢慢注入接種物。接種完畢，皮膚應(yīng)縫合一兩針。

（3）小白鼠靜脈接種  作小白鼠靜脈內(nèi)接種時(shí)，選尾側(cè)靜脈，體重在15~20克為宜。因其尾部皮膚比較柔軟、菲薄，靜脈管清晰可見，若體重在20克以上時(shí)，尾部皮膚較厚、較硬，對(duì)缺乏經(jīng)驗(yàn)的人更難于注射好。接種時(shí)用一玻璃杯扣住小白鼠，露出尾部，用最小號(hào)針頭刺入尾側(cè)靜脈，緩緩注入接種物，注射時(shí)無阻力，皮膚不變白、不隆起，表示注入到靜脈內(nèi)。

5、腦內(nèi)接種法  作病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，有時(shí)用腦內(nèi)接種法，通常多用小白鼠，特別是乳鼠（1~3日齡），接種時(shí)通常使小白鼠以作輕度麻醉，用碘酒消毒其顱部毛皮再以酒精棉球拭去碘液，用1毫升結(jié)核菌素注射器，以最小號(hào)針頭吸取接種，于兩耳根連接線中點(diǎn)略偏左（或右）處，以皮膚及顱骨稍向下刺入少許即可，注射完畢拔出針頭，以棉球壓住針孔片刻。接種乳鼠時(shí)一般不麻醉，不用碘酒。       

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